mini|Chromatographische Trennung von Blattfarbstoffen, bei der sowohl die Xanthophylle als auch Chlorophyll a und b jeweils als Banden sichtbar werden.
Chromatographie, Chromatografie ( „Farbe“ [Stamm ] und -graphie, sinngemäß „Farbenschreiben“) wird in der Chemie ein Verfahren genannt, das die Auftrennung eines Stoffgemisches durch unterschiedliche Verteilung seiner Einzelbestandteile zwischen einer stationären und einer mobilen Phase erlaubt. Dieses Prinzip wurde erstmals 1901 von dem russischen Botaniker Michail Semjonowitsch Zwet beschrieben, 1903 wurde es zum ersten Mal öffentlich gedruckt beschrieben, 1906 benutzte er erstmals den Begriff „Chromatographie“. Er untersuchte gefärbte pflanzliche Extrakte, zum Beispiel aus Blattmaterial, und konnte daraus durch Chromatographie verschiedene Farbstoffe isolieren. Anwendung findet diese Methode zum einen in der Produktion zur Reinigung von Substanzen (= präparative Chromatographie), zum anderen in der chemischen Analytik, um Stoffgemische in möglichst einheitliche Inhaltsstoffe zwecks Identifizierung oder mengenmäßiger Bestimmung aufzutrennen. Die Chromatographie wird in der organischen Chemie, der Pharmazie, der Biochemie, der Biotechnologie, der Mikrobiologie, der Lebensmittelchemie, der Umweltchemie und auch in der anorganischen Chemie angewendet.
Prinzip der Chromatographie mini|300px|Zusammenhänge in der Chromatographie und Vergleiche
In der Chromatographie werden unterschiedliche Substanzen (= Treibgut) in der so genannten mobilen Phase (= Wasser) auf einer stationären Phase (= Flussbett) befördert. Aufgrund der Wechselwirkungen (siehe die Einteilung unter Trennprinzipien) zwischen der Probe, der stationären Phase und der mobilen Phase werden einzelne Substanzen unterschiedlich schnell weitertransportiert und somit voneinander getrennt: Ein Gemisch aus Sand, sehr kleinen und etwas größeren Kieselsteinen wird an einer Stelle des Flusses eingebracht; nach beispielsweise hundert Metern kommt zuerst der gesamte Sand an (verteilt auf eine gewisse Zeit) und nach einer gewissen Wartezeit kommen alle kleineren Kieselsteine und noch viel später die größeren, jeweils zeitlich etwas auseinandergezogen.
Dieser Vergleich eignet sich für einen ersten Einstieg. Tatsächlich erinnert der Prozess (bei der Chromatographie) eher an einen „digitalen“ Prozess (engl. ). Die Probemoleküle werden entweder mit der mobilen Phase mitgenommen (mit der Geschwindigkeit der mobilen Phase – Analogie wäre ein Floß, das passiv in einem Strom mitgeführt wird) oder sie haften an der stationären Phase (Geschwindigkeit gleich Null). Zwischen diesen beiden Möglichkeiten wechseln sie sehr rasch hin und her (aufgrund der Wärmebewegung erhalten sie ständig Stöße). Der Vergleich mit dem Flussbett könnte auch zu einem weiteren Missverständnis führen: die Verzögerungen, die die verschiedenen Probemoleküle auf dem Weg durch das chromatographische System erleiden, haben nichts mit Reibungsphänomenen zu tun. Basis für das Verständnis sind Unterschiede in der Verteilung (der verschiedenen Molekülsorten A, B, C usw.). Sie entsprechen Unterschieden im Zeitanteil (den die einzelnen Moleküle vom Typ A, B, C usw. im Mittel in der mobilen Phase verbringen). Die Chromatographie schafft es, diese Unterschiede in Geschwindigkeitsunterschiede zu verwandeln und damit für eine Trennung gut nutzbar zu machen. Das könnte man auch als den „Trick“ oder als das Prinzip der Chromatographie bezeichnen. Ansonsten wären diese oft recht kleinen Unterschiede kaum zu nutzen, weder für Trenn- und Reinigungsprozesse, noch für Analysen.
Anhand eines Beispiels ist es leichter zu verstehen: Wenn sich 45 % der A-Moleküle in der mobilen Phase aufhalten (im Mittel), kommt es auf Grund des dynamischen Gleichgewichtes dazu, dass die individuellen A-Moleküle auch 45 % der Zeit in der mobilen Phase verbringen (im Mittel). Daher wird ihre Geschwindigkeit 45 % der Geschwindigkeit der mobilen Phase betragen (im Mittel). Für gute Ergebnisse bei der Chromatographie ist es entscheidend, dass der Stoffaustausch zwischen den beiden Phasen sehr rasch erfolgt, das heißt die einzelnen Probemoleküle sollen sehr oft zwischen den beiden Phasen hin und her wechseln (Diffusionsprozesse, Wärmebewegung). Eine Voraussetzung dafür ist, dass die Wege, welche die Moleküle von der stationären Phase zur mobilen Phase zurückzulegen haben, sehr kurz sind. Falls die stationäre Phase ein Pulver enthält, sollte die Korngröße dieses Pulvers sehr klein sein (zum Beispiel nur wenige Mikrometer). Aus bestimmten Gründen sollten die Pulverkörner auch möglichst einheitlich geformt sein und eine möglichst einheitliche Größe aufweisen (enge Korngrößenverteilung).
Prozess mini|Schematische Darstellung
Für die Chromatographie sind die Herstellung des Flusses der mobilen Phase, die Injektion der zu trennenden Probe, die eigentliche Trennung und die Detektion nötig. Das Fließen der mobilen Phase wird entweder mittels Druck (hydraulischen Pumpe, Gasdruck), Kapillarkraft oder durch Anlegen einer elektrischen Spannung erreicht.
Die Injektion (= Einbringen des Substanzgemisches in das chromatographische System) erfolgt entweder, bevor der Fluss der mobilen Phase hergestellt wird (z. B. Dünnschichtchromatographie) oder während die mobile Phase bereits fließt. Bei einer großen Anzahl von Proben werden bei automatisierbaren Chromatographiearten sogenannte Autosampler (zusammen mit eigenen Datenerfassungssystemen) eingesetzt, die vollautomatisch die Proben injizieren.
Anschließend erfolgt die eigentliche Auftrennung des Substanzgemisches auf der Trennstrecke. Ohne Detektion (= sichtbar machen, wann eine Substanz einen bestimmten Teil des Chromatographiesystems passiert oder wo eine Substanz nach dem Beenden des Prozesses zum Liegen kommt) ist eine Chromatographie nicht denkbar. Für jede Chromatographieart werden verschiedene Detektionssysteme eingesetzt, indem entweder physikalische Eigenschaften (Absorption von Licht, Fluoreszenz, Lichtstreuung, Wärmeleitfähigkeit.) der Substanzen ausgenutzt werden oder durch chemische Reaktionen ein Signal erhalten wird. Mittels chemischer Reaktionen wird z. B. eine Färbung bei der planaren Chromatographie erreicht (z. B. Aminosäuren mittels Ninhydrin, seit 1948Stanford Moore, William H. Stein: Photometric ninhydrin method for use in the chromatography of amino acids. In: J Biol Chem. Band 176, 1948, S. 367 ff.) oder Reaktionen vor dem Auftrennen (Vorsäulenderivatisierung) oder nach dem Auftrennen (Nachsäulenderivatisierung) bei der Säulenchromatographie durchgeführt.
Bei der präparativen Chromatographie wird anschließend noch ein Fraktionensammler zum Auffangen der aufgetrennten Substanz benötigt.
Bauartbedingt handelt es sich bei chromatographischen Aufreinigungsverfahren immer um Batch-Verfahren. Dies bedeutet, dass immer nur eine bestimmte Menge an Substanz aufgetragen und getrennt werden kann, bevor mit der nächsten Menge fortgefahren werden kann. Dies ist insbesondere bei der Aufarbeitung großer Mengen problematisch, so dass einige Verfahren entwickelt wurden, um Chromatographie kontinuierlich betreiben zu können: Annulare Chromatographie, TMB (True Moving Bed) Chromatographie und SMB-(Simulated Moving Bed) Chromatographie.
Begrifflichkeiten und Prinzip Stationäre Phase Die stationäre Phase ist die Phase, die mit den einzelnen Substanzen des Substanzgemisches Wechselwirkungen eingeht und sich nicht bewegt. Der Aufenthalt der Analyten bei ihrer Retention wechselt zwischen mobiler und stationärer Phase (random walk) und verursacht die substanzcharakteristische Retentionszeit. Die stationäre Phase besteht in der Gaschromatographie aus einer Flüssigkeit (Trennflüssigkeit) oder einem Gel, mit welchem die Innenseite der Kapillare beschichtet ist. Bei der Flüssigchromatographie ist die stationäre Phase normalerweise fest, kann aber auch eine Flüssigkeit sein, die mit der mobilen Phase nicht mischbar ist und den pulverförmigen Träger benetzt. Schließlich kann die stationäre Phase auch aus chemisch an den Träger gebundenen Molekülen bestehen.
Mobile Phase Die mobile Phase ist die Phase, in die das Substanzgemisch zu Beginn des Trennsystems eingebracht und die bewegt wird. Bei der Flüssigchromatographie ist die mobile Phase flüssig. Bei der Gaschromatographie kommen Trägergase wie Wasserstoff, Helium oder Stickstoff zum Einsatz, in der Dünnschichtchromatographie spricht man vom Fließmittel. Mobile Phasen unterscheiden sich in ihrer Elutionsfähigkeit („Stärke“ s. u. „Elutrope Reihe“), dies bedingt unterschiedliche Retentionszeiten und oft auch unterschiedliche Selektivitäten.
Retention Unter Retention versteht man den verzögerten Durchfluss einzelner Substanzen des Substanzgemisches der mobilen Phase durch Wechselwirkung mit der stationären Phase.
Die Retention einer Substanz durch die stationäre Phase wird im Wesentlichen durch drei Aspekte bestimmt: Stärke der Wechselwirkung der Substanz mit der stationären Phase („Neigung in der stationären Phase zu bleiben“) Siedepunkt der Substanz („Neigung in der mobilen Phase zu bleiben“) Diffusionseigenschaften der Substanz („Beweglichkeit in der stationären und mobilen Phase“)
In vielen Fällen wird gezielt eine spezielle Wechselwirkung des zu analysierenden Stoffes mit der stationären Phase genutzt, um Substanzen zu trennen. Die Stärke der Wechselwirkungen zwischen den Probenkomponenten und der stationären Phase wird sowohl von deren Struktur als auch von deren funktionellen Gruppen bestimmt. Dabei treten bei unpolaren Substanzen ausschließlich Dispersionswechselwirkungen (Van-der-Waals-Bindung) auf, während polare Trennphasen auch polare Wechselwirkungen eingehen können, etwa Wasserstoffbrückenbindungen oder Donator-Akzeptor-Bindungen. Letztere trennen nach dem Prinzip: Gegensätze ziehen sich an. Das bedeutet, dass Trennphasen, die etwa Wasserstoff zur Wasserstoffbrückenbindung aufzunehmen in der Lage sind Substanzen trennen, die Wasserstoff zur Brückenbindung bereitstellen können (etwa Alkohole). Auch können zum Beispiel Enantiomere, welche sich in ihren Siedepunkten nicht unterscheiden und somit gleiche Retentionszeiten aufweisen würden, durch ihre verschieden starken Wechselwirkungen mit speziellen Derivaten von Cyclodextrinen aufgetrennt werden.
Retentionszeit Die Retentionszeit ist die Zeit, die die Moleküle eines reinen Stoffes zum Durchwandern der Säule von der Injektion bis zur Detektion benötigen.
Im Gegensatz zu den Trägergasen zeigen die meisten chemischen Stoffe eine Wechselwirkung mit der stationären Phase, d. h., sie halten sich für eine gewisse Zeit in der stationären Phase auf. Ihre Aufenthaltsdauer in der stationären Phase addiert sich zur Aufenthaltsdauer in der mobilen Phase (Totzeit), sie benötigen also insgesamt länger, um die ganze GC-Säule zu passieren. Ursprünglich leitet sich der Begriff Retention (Zurückhaltung) davon ab, dass die stationäre Phase den Analyten für eine gewisse Zeit zurückhält. Heutzutage wird der Begriff Retentionszeit allerdings vereinfacht verwendet für die Zeit, die der Analyt zum Passieren der Säule benötigt und dies schließt also die Totzeit mit ein. Daher werden die Begriffe folgendermaßen definiert:
Retentionszeit (tR): Ist die Gesamtzeit, die ein Analyt für das Passieren der Säule benötigt. Dies entspricht der Zeit zwischen Injektion und Detektion des Analyten. Totzeit (t0): Ist die Zeit, in der sich ein Analyt ohne Wechselwirkung mit der stationären Phase in der mobilen Phase aufhält; entspricht also der Zeit, die die mobile Phase zum Durchlaufen der Säule benötigt. Nettoretentionszeit oder reduzierte Retentionszeit (tN): Ist die Differenz aus Retentionszeit und Totzeit. Sie entspricht also der Zeit, in der sich ein Analyt in der stationären Phase aufhält. tN = tR – t0
Durchflusszeit (Totzeit)