mini|Spiegelei – Das Protein (Eiweiß) erfährt durch Zufuhr von Energie in Form von Wärme (Braten) eine Denaturierung (Gerinnung).
Denaturierung bezeichnet eine strukturelle Veränderung von Biopolymeren wie Proteinen oder Desoxyribonukleinsäure (DNS), die in den meisten Fällen mit einem Verlust der biologischen Funktion dieser Moleküle verbunden ist, obgleich deren Primärstruktur unverändert bleibt. Eine Denaturierung kann auf physikalische oder auf chemische Einflüsse zurückzuführen sein.
Prinzip Äußere Einflüsse können nach dem Prinzip des kleinsten Zwangs Strukturveränderungen in Biopolymeren wie Proteinen oder Nukleinsäuren hervorrufen. Die Kettenstruktur der Molekülkette und damit die Abfolge der Bausteine (Primärstruktur) bleibt bei einer Denaturierung erhalten. Doch werden durch Energiezufuhr einzelne Bausteine wie Nukleotide und Aminosäuren oder auch die ganze Molekülkette so sehr ins Schwingen gebracht bzw. durch Zugabe denaturierender Moleküle so verändert, dass andere bindend wirkende Kräfte (ionische, polare und Van-der-Waals-Wechselwirkungen, Wasserstoffbrückenbindungen, hydrophobe Effekte) zwischen verschiedenen Bereichen der Molekülkette aufgehoben und solche Bindungen gelöst werden.
Der Vorgang der Denaturierung kann irreversibel (unumkehrbar) oder reversibel (umkehrbar) sein, abhängig davon, ob die native Form auch den energetisch günstigsten Zustand darstellt. Der Umkehrvorgang einer Denaturierung heißt auch Renaturierung.Hans-Dieter Jakubke, Hans Jeschkeit: Aminosäuren, Peptide, Proteine, Verlag Chemie, Weinheim 1982, ISBN 3-527-25892-2, S. 402. Solche reversiblen Veränderungen der Molekülstruktur liegen beispielsweise bei der Hitzedenaturierung von DNA vor, wenn diese durch Erhitzen in Einzelstränge aufgebrochen wird – etwa für eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) – und anschließend wieder abkühlt. Dagegen kann nach einer irreversiblen Veränderung der Molekülstruktur der ursprüngliche räumliche Aufbau des Moleküls nicht wiederhergestellt werden. Solche Veränderungen erfährt zum Beispiel ein Frühstücksei beim Kochen,Yoshinori Mine, Tatsushi Noutomi, Noriyuki Haga: Thermally induced changes in egg white proteins. In: Journal of Agricultural and Food Chemistry. 38, 1990, S. 2122, . das weder durch Abkühlen in den Vorzustand überführbar ist, wenn es erst einmal ein „hartes Ei“ geworden ist, noch durch weiteres Kochen. Konformationsänderungen in Biopolymeren können im Labor mit FTIR, dualer Polarisationsinterferometrie, Circulardichroismus, QCM-D, Kryoelektronenmikroskopie, STED-Mikroskopie, SMLM-Mikroskopie, NMR-Spektroskopie und multiparametrischer Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie gemessen werden.
Proteine mini|Einerseits steigt die Aktivität eines Enzyms mit der Temperatur (oben), andererseits gibt es eine Denaturierungstemperatur (Mitte), wodurch sich die untere Kurve ergibt Allen Denaturierungsvorgängen von Proteinen ist gemeinsam, dass kovalente Bindungen nicht gespalten werden (außer den Disulfid-Brücken in Proteinen) und somit die Primärstruktur erhalten bleibt.Charles Tanford: Protein denaturation. In: Advances in protein chemistry. Band 23, 1968, S. 121–282, PMID 4882248. Disulfidbrücken in Proteinen werden im Labor meistens durch Reduktion mit Sulfhydrylen gespalten.H. Robert Horton et al.: Biochemie. Pearson Deutschland GmbH, 2008, ISBN 978-3-8273-7312-0, S. 144–146. Bei Proteinen wird bei einer Denaturierung oftmals eine Absenkung der Löslichkeit beobachtet, teilweise begleitet von der Bildung von Proteinaggregaten, die sich bei höheren Konzentrationen visuell als Verklumpung erkennen lässt. Ebenfalls steigt bei einer Denaturierung die Empfindlichkeit gegenüber einem Abbau durch Proteasen. Die Denaturierung von Proteinen führt in der Regel dazu, dass das Molekül inaktiviert wird, was heißt, dass es seine biologische Funktion kaum noch oder gar nicht mehr erfüllen kann. Daher wird die Denaturierung auch bei der Konservierung und der Desinfektion eingesetzt.
Bei der Denaturierung eines Proteins verändert sich die Proteinfaltung (die Sekundär- und die Tertiärstruktur und damit eventuell auch die Quartärstruktur), ohne dass sich die Reihenfolge der Aminosäuren ändert, die dessen Primärstruktur darstellt. Das Protein verliert jedoch dabei seine ursprüngliche Faltungsform, die auch als native Konfiguration oder Konformation der Polypeptidkette bezeichnet wird. Mit dem Verlust der Faltung geht auch die Funktion des Proteins verloren, mit Ausnahme bei den intrinsisch unstrukturierten Proteinen.Jane H. Dyson, Peter E. Wright: Intrinsically unstructured proteins and their functions In: Nature Reviews Molecular Cell Biology. (2005), Band 6, Ausgabe 3, S. 197–208. doi:10.1038/nrm1589. Da viele Proteine renaturierbar sind und ihre Funktion wiederhergestellt werden kann,Philipp Christen, Rolf Jaussi, Roger Benoit: Biochemie und Molekularbiologie. Springer-Verlag, 2015, ISBN 978-3-662-46430-4, S. 36, 37. wurde postuliert, dass die Proteinfaltung bei der Proteinbiosynthese deshalb erfolgt, weil die native Form meist den energetisch günstigsten Zustand darstellt (Anfinsen-Dogma).C. B. Anfinsen: Principles that govern the folding of protein chains. In: Science. Band 181, Nummer 4096, Juli 1973, S. 223–230, PMID 4124164.
DNA und RNA mini|tRNA wird bei einer Denaturierung zu einer losen Kette entfaltet Bei Nukleinsäuren (DNA und RNA) bilden sich Wasserstoffbrücken zwischen den einzelnen Nukleotiden aus, was als Basenpaarung bezeichnet wird. Daraus ergeben sich Paarungsmöglichkeiten innerhalb einer Kette (wie z. B. bei tRNA) oder zwischen zwei Ketten (wie z. B. bei einer DNA-Doppelhelix). Doppelsträngige DNA und RNA wird bei der Basenpaarung durch Wasserstoffbrückenbindungen zusammengehalten, die bei einer Denaturierung reversibel gelöst werden. Durch eine Denaturierung wird die Kette durch Zufuhr von Energie durch eine Aufhebung der Wasserstoffbrücken entfaltet. Dabei wird auch die Basenpaarung zwischen zwei gepaarten Ketten getrennt.G. Witz, A. Stasiak: DNA supercoiling and its role in DNA decatenation and unknotting. In: Nucleic acids research. Band 38, Nummer 7, April 2010, S. 2119–2133, , PMID 20026582, .R. Thomas: The denaturation of DNA. In: Gene. Band 135, Nummer 1–2, Dezember 1993, S. 77–79, , PMID 8276281.
Denaturierung durch physikalische Einflüsse Die häufigsten Denaturierungen unter physikalischem Einfluss sind die Hitzedenaturierung und die Strahlungsdenaturierung. Physikalisch kann Denaturierung daneben auch durch hohen Druck, starkes Rühren, Schütteln, durch Ultraschalleinwirkung und durch Grenzflächenabsorption hervorgerufen werden.Hans-Dieter Jakubke, Hans Jeschkeit: Aminosäuren, Peptide, Proteine, Verlag Chemie, Weinheim, 403, 1982, ISBN 3-527-25892-2.
Hitzedenaturierung mini|Enzymaktivität in Abhängigkeit von der Temperatur. Bei der Denaturierungstemperatur verliert das Enzym seine Aktivität. mini|Entfaltung eines Proteins durch Wärme Die Wärme- oder Hitzedenaturierung ist eine Art der Denaturierung, bei der eine Veränderung der Molekülstruktur durch eine Erhöhung der Temperatur herbeigeführt wird. Dabei werden durch die Hitzeeinwirkung meist keine kovalenten chemischen Bindungen gebrochen oder gebildet, die Primärstruktur bleibt also unverändert. Stattdessen werden Wasserstoffbrücken gebrochen oder neu gebildet, das sind in der Regel Bindungen zwischen Kettenabschnitten, wodurch häufig eine Veränderung der Tertiärstruktur bei Enzymen und anderen Proteinen eintritt. Dies hat meist einen Verlust der biologischen Aktivität sowie eine Abnahme der Löslichkeit zur Folge. Letzteres macht sich dann als „Ausflocken“ oder „Gerinnung“ bemerkbar. Da bei der Proteinfaltung auch hydrophobe Effekte eine Rolle spielen, wird die Denaturierung auch von der Abnahme des hydrophoben Effektes mit zunehmender Temperatur erzeugt. Eine Hitzedenaturierung kann (wie andere Denaturierungen) reversibel sein, wenn die strukturellen Veränderungen noch nicht zu tiefgreifend sind, häufig ist sie aber irreversibel (unumkehrbar). Eine Umkehrung ist jedoch unter Laborbedingungen mit Hilfe von Zentrifugen und der Zugabe von Harnstoff teilweise möglich. Durch die auftretenden Scherkräfte können Hühnereier beispielsweise teilweise „entkocht“ werden.Yuan et al.: Shear-Stress-Mediated Refolding of Proteins from Aggregates and Inclusion Bodies. In: ChemBioChem. Nr. 16, 2015, S. 393–396. Die Temperatur, bei der die Denaturierung der Proteine beginnt, ist je nach Aufbau und Organismus recht unterschiedlich. Die Enzyme hyper-thermophiler Archaeen müssen Temperaturen weit über 80 °C aushalten. Die Denaturierung durch Erhitzen wird in leicht saurer Lösung verstärkt.Peter Karlson: Karlsons Biochemie und Pathobiochemie. Georg Thieme Verlag, 2005, ISBN 978-3-13-357815-8, S. 35. Die thermische Denaturierung von Proteinen erfolgt meist in einem relativ engen Temperaturbereich, weshalb eine kooperative Entfaltung bei der Denaturierung vermutet wurde, d. h. eine Entfaltung begünstigt weitere.
Durch Autoklavieren werden Krankheitserreger auf Gegenständen mittels Denaturieren lebenswichtiger Biopolymere inaktiviert. Beim Autoklavieren muss eine Temperatur deutlich über 100 °C bei erhöhtem Druck über eine vorgegebene Zeit eingehalten werden, um sicher zu sterilisieren. Autoklavierung wird in der Herstellung und Reinigung von Medizinprodukten eingesetzt, eignet sich jedoch nicht für hitze- oder feuchtigkeitssensible Materialien, daher werden derartige Produkte oft mit ionisierender Strahlung behandelt, häufig aus Cobalt-60.
Nukleinsäuren denaturieren innerhalb eines recht engen Temperaturintervalls, auch „Schmelzpunkt“ genannt, der meist oberhalb von 80 °C liegt. Die Denaturierung ist reversibel. Durch ein Abkühlen der Nukleinsäuren lagern sich die Einzelstränge wieder zusammen. Diesen Vorgang macht man sich in der Molekularbiologie bei der Durchführung von PCR zunutze, um bestimmte Gene aus einem Organismus in vitro zu vervielfältigen: extrahierte DNA wird bei hohen Temperaturen von etwa 95 °C in einem Reaktionsgefäß geschmolzen (Denaturierung). Anschließend wird die Temperatur wieder bis zu einer bestimmten Temperatur abgesenkt. Diese Annealing-Temperatur hängt von den Primern ab und liegt normalerweise 2–3 °C unter ihrem jeweiligen Schmelzpunkt (meistens 50 bis 65 °C). Die in der Lösung enthaltenen Primer lagern sich an die DNA-Einzelstränge an (Annealing oder auch Primerhybridisierung genannt). Nun werden mit Hilfe einer thermostabilen DNA-Polymerase (wie die Taq-Polymerase) die Stränge bei einer Temperatur von 68 bis 72 °C wieder vervollständigt (Elongation). Der Zyklus von Denaturierung, Annealing und Elongation beginnt von vorn. Es werden etwa 25 bis 50 Zyklen durchgeführt. Man macht sich also die reversible Denaturierung der DNA bis zu 50-mal zunutze, um ein gesuchtes Gen eines Organismus zu vervielfältigen. Bei einer Denaturierung nimmt die Extinktion von DNA bei einer Wellenlänge von 260 nm um etwa 40 % zu.Gerhard Richter: Praktische Biochemie. Georg Thieme Verlag, 2003, ISBN 978-3-13-132381-1, S. 144, 195.
Denaturierung durch Druck Da die Reaktionsvolumina bei der Proteinfaltung sehr klein sind, muss man in der Regel Druck von mehreren 1000 bar aufwenden, um Proteine zu entfalten. Trotzdem wird in der Praxis die Hochdruckbehandlung von LebensmittelnE. Palou, A. Lopet-Malo, G. V. Barbosa-Canovas und B. G. Swanson: High Pressure Treatment in Food Preservation, Marcel Dekker, New York 1999. immer bedeutsamer. Dazu werden die Lebensmittel, zumeist in Folien verpackt, in ein Druckmedium, wie z. B. Wasser, gegeben und der Druck wird auf dieses Medium ausgeübt. In diesem „nichtthermischen Verfahren“, einer Hochdruckpasteurisierung, werden unerwünschte Mikroorganismen und Enzyme inaktiviert und die Lebensmittel haltbar gemacht. Qualitätsverluste, wie bei der Anwendung von Hitze, werden dabei vermieden.
Generell gilt, dass durch Druck die Tertiär- und Quartärstruktur der Proteine beeinflusst wird, während die Sekundärstruktur kaum verändert werden kann.