mini|Inneres eines CO2-Inkubators mit Zellkulturplatten und -flaschen
Als Zellkultur wird die Kultivierung tierischer oder pflanzlicher Zellen in einem Nährmedium außerhalb des Organismus bezeichnet. Es werden sowohl immortalisierte (unsterbliche) Zelllinien als auch primäre Zellen kultiviert (Primärkultur). Als Primärkultur bezeichnet man eine nicht immortalisierte Zellkultur, die direkt aus einem Gewebe gewonnen wurde. Zellkulturen finden breite Verwendung in der biologischen und medizinischen Forschung, Entwicklung und Produktion.
Eigenschaften mini|Steriles Arbeiten in einer Sicherheitswerkbank Klasse II Die Arbeiten mit Zellen erfolgen meistens in einem Zellkulturlabor unter sterilen Bedingungen. Dies erfolgt in einer Sicherheitswerkbank der Klasse 2 oder höher mit sterilen Arbeitsgeräten und -material. Zur Vermeidung von mikrobiologischen Kontaminationen der Zellkultur werden desinfizierte Einmalhandschuhe und meist ein regelmäßig gewechselter Laborkittel mit Verschluss auf dem Rücken verwendet.
Die Kulturbedingungen unterscheiden sich stark zwischen den einzelnen kultivierten Zelllinien. Die verschiedenen Zelltypen bevorzugen dabei unterschiedliche Nährmedien, die spezifisch zusammengestellt werden, beispielsweise unterschiedliche pH-Werte oder Konzentration an Nährstoffen. In der Regel wachsen Säugerzellen bei 37 °C mit einer Atmosphäre von 5 % CO2 in speziellen Inkubatoren bei einer relativen Luftfeuchte von 95 %.Gerhard Gstraunthaler, Toni Lindl: Zell- und Gewebekultur. 8. Auflage, Springer, 2021. . S. 126–130. Die Temperatur und CO2-Konzentration imitieren physiologische Bedingungen, während die Luftfeuchte eine Verdunstung des Wassers im Zellkulturmedium vermeidet. Um eine ausreichende Versorgung mit Luftsauerstoff zu ermöglichen, ist weniger als ein Zentimeter Höhe an Medium über den Zellen. Als Zellkulturgefäße werden Zellkulturflaschen und für einzelne Versuche Kammern in einer Zellkulturschale verwendet. Diese sind auf der Bodenfläche innen meist mit Polylysin beschichtet, damit sich adhärente Zellen besser daran anhaften können.
Bei 3D-Zellkulturen von Zellen in Bioreaktoren mit Microcarriern ist der Arbeitsaufwand geringer, aber der Einsatz erst bei größeren benötigten Mengen sinnvoll und es sind zusätzliche Geräte notwendig, die nicht in üblichen Zellkulturlaboren vorkommen. Amphibien- und Insektenzellen wachsen bei 28 °C auch ohne CO2-Zugabe.
Adhärente und Suspensionszellen mini|Zellkulturflaschen verschiedener Größen. Je größer die Grundfläche, desto mehr Zellen können wachsen. mini|Zellkulturschale mit 6 Kammern Man unterscheidet auch adhärent (anhaftend) auf Oberflächen wachsende Zellen wie beispielsweise Fibroblasten, Endothelzellen oder Knorpelzellen von Suspensionszellen, die frei im Nährmedium schwimmend wachsen, wie zum Beispiel Lymphozyten und die meisten anderen Blutzellen. Während adhärente Zellen nach dem langsamen Absinken sich an der Oberfläche des Bodens des Zellkulturgefäßes anhaften, sinken Suspensionszellen in Zellkultur nur ab. Dementsprechend unterscheidet sich die Art der Passagierung, denn Suspensionszellen müssen nicht mit einer Protease behandelt werden.
Primärzellen Das Anlegen von Primärkulturen (nicht-immortalisierte Zellen) kann aus unterschiedlichen Geweben über verschiedene Methoden erfolgen.Sabine Schmitz: Der Experimentator: Zellkultur. 4. Auflage, Springer Spektrum, 2020. ISBN 978-3-662-58951-9. S. 112–126. Das Gewebe wird mit Schere, Stößel und Sieb mechanisch zerkleinert und die Zellen von Sehnen und Gefäßen getrennt. Alternativ existieren Geräte zum halbautomatisierten Gewebeaufschluss. Die Zellen werden mit einer Protease behandelt, meistens Trypsin (Trypsinisierung), Pronase oder Kollagenase, welche die extrazelluläre Matrix teilweise verdaut und Zellkontakte abbaut, die den Zellverband aufrechterhalten. Dadurch werden die Zellen vereinzelt. Langsames Auf- und Abpipettieren vereinzelt die Zellen weiter unter Vermeidung größerer Scherkräfte, welche die Zellmembrane reißen lassen. Anschließend werden die vereinzelten Zellen in Zellkulturmedium aufgenommen. Alternativ kann eine Biopsie direkt in Zellkultur gehalten werden, wobei dann nur die Zellen der Oberfläche wachsen (Explantkultur). Durch Zugabe von Wachstumsfaktoren können gezielt manche Zelltypen zur Teilung angeregt werden. Bei schlecht wachsenden Zelltypen werden auch Fütterzellen, basalmembranartige Matrices und rekombinante oder gereinigte Bestandteile der extrazellulären Matrix verwendet. Zelllinien brauchen dagegen nur eine Passagierung.
Zelllinien mini|CHO-Zellen in Zellkultur
Die meisten Zellen besitzen eine eingeschränkte Lebensdauer (begrenzt durch das Hayflick-Limit), mit Ausnahme von einigen von Tumoren abstammenden Zellen und immortalisierten Zellen. Nach einer bestimmten Anzahl von Verdopplungen (circa 40 – 60 Zellteilungen) gehen die begrenzten Zellen in die Zellseneszenz und teilen sich nicht mehr.L. Hayflick: A brief history of the mortality and immortality of cultured cells. In: The Keio journal of medicine. Band 47, Nummer 3, September 1998, S. 174–182, , PMID 9785764. Etablierte oder unsterbliche Zelllinien haben die Fähigkeit erlangt, sich unendlich zu teilen – entweder durch zufällige Mutation (in Tumorzellen) oder durch gezielte Veränderung (durch Immortalisierung). Aufgrund der im Vergleich zu Primärzellen hohen Wachstums- und Zellteilungsrate und der unbegrenzten Teilungsfähigkeit werden Zelllinien standardmäßig in der Zellkultur verwendet. Es gibt mehrere tausend Zelllinien unterschiedlicher Tier- und Pflanzenarten.
Methoden Zellkulturmedium mini|Zellkulturflaschen mit Zellen und Medium. Der Deckel ist luftdurchlässig (entweder mit eingebautem Sterilfilter oder nur lose aufgesetzt), um eine Versorgung mit O2 zu ermöglichen und die Konzentration von CO2 zu regulieren.
Nährmedien für die Kultur von Säugetierzellen sind beispielsweise RPMI-1640,G. E. Moore, R. E. Gerner, H. A. Franklin: Culture of normal human leukocytes. In: Journal of the American Medical Association. Band 199, Nummer 8, Februar 1967, S. 519–524, PMID 4960081. Eagle’s Minimal Essential Medium,H. Eagle: Amino acid metabolism in mammalian cell cultures. In: Science. Band 130, Nummer 3373, August 1959, S. 432–437, , PMID 13675766. Dulbecco's Modified Eagle Medium,R. Dulbecco, G. Freeman: Plaque production by the polyoma virus. In: Virology. Band 8, Nummer 3, Juli 1959, S. 396–397, , PMID 13669362. Ham's F-10, Ham's F-12,R. G. Ham: Clonal Growth of Mammalian Cells in a chemically defined, synthetic Medium. In: Proceedings of the National Academy of Sciences. Band 53, Nummer 2, Februar 1965, S. 288–293, , PMID 14294058, . Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM),I. Macpherson, M. Stoker: Polyoma transformation of hamster cell clones–an investigation of genetic factors affecting cell competence. In: Virology, Band 16, Februar 1962, S. 147–151, , PMID 14468055. Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM)N. N. Iscove, F. Melchers: Complete replacement of serum by albumin, transferrin, and soybean lipid in cultures of lipopolysaccharide-reactive B lymphocytes. In: The Journal of Experimental Medicine. Band 147, Nummer 3, März 1978, S. 923–933, , PMID 305462, . und für die Insektenzellkultur Trichoplusia ni Medium-Formulation Hink (TNM-FH, z. B. Grace’s Insect Medium, Supplemented).W. F. Hink: A serum-free medium for the culture of insect cells and production of recombinant proteins. In: In vitro cellular & developmental biology : journal of the Tissue Culture Association. Band 27A, Nummer 5, Mai 1991, S. 397–401, , PMID 1906456.
Passagieren
Strikt adhärente Zelllinien in kontinuierlicher Kultur hören mit dem Wachstum auf, wenn die gesamte Wachstumsfläche von Zellen bedeckt wurde (Zellkontakthemmung). Außerdem droht ein Absterben der Kultur, wenn die Zelldichte zu hoch ist und damit die Proliferationsrate erheblich sinkt – die Maximaldichte ist erreicht. In diesem Fall löst man die Zellen enzymatisch aus der Wachstumsfläche, verdünnt und überführt sie in neue Kulturgefäße. Dieser Prozess wird als Passagieren bezeichnet (auch „Subkultivieren“, „Passage“ oder „Splitting“ genannt). Je nach Teilungsrate, Dichte und Art der Zellen erfolgt dieser Zeitpunkt unterschiedlich – während 3T3-Zellen namensgebend alle 3 Tage passagiert werden, sollten dies bei stark wachsenden Tumorzelllinien früh in der stationären Phase bzw. vor Erreichen der Konfluenz erfolgen. Die Passagezahl gibt dabei die Häufigkeit an, mit der die Zellen bereits passagiert wurden, sie erhöht sich bei jedem Passagieren um 1.
Anzahl und Zellviabilität Die Anzahl kann direkt nach dem Passagieren mit einer Zählkammer für eukaryotische Zellen und einem Inversmikroskop oder mit einem Coulter-Zähler bestimmt werden. Daneben kann die Lebendzellzahl bestimmt werden.Gerhard Gstraunthaler, Toni Lindl: Zell- und Gewebekultur. 8. Auflage, Springer, 2021. . S. 165–172.
Lagerung Je nach Lagerungsdauer werden unterschiedliche Temperaturen und Lagerungsmedien verwendet. Während die Zellkultur von Säugetierzellen bei 37 °C und 5 % CO2 erfolgt, können Zellen für wenige Stunden im Kühlschrank aufbewahrt werden.J. Wang, Y. Wei, S. Zhao, Y. Zhou, W. He, Y. Zhang, W. Deng: The analysis of viability for mammalian cells treated at different temperatures and its application in cell shipment. In: PLOS ONE. Band 12, Nummer 4, 2017, S. e0176120, , PMID 28419157, . Durch Zentrifugation kann der Zeitraum der Lagerung bei 4 °C verlängert werden.L. Mocé-Llivina, J. Jofre: A method to maintain mammalian cells for days alive at 4 degrees C. In: Cytotechnology. Band 46, Nummer 1, September 2004, S. 57–61, , PMID 19003259, . Eine längerfristige Lagerungsmöglichkeit bietet die Kryokonservierung, beispielsweise in einem -80 °C Gefrierschrank oder in Flüssigstickstoff.
Anwendung Zellkulturen finden besonders in Forschung und Entwicklung breite Anwendung. In der Forschung werden sie als Modellsystem für tierische Zellen verwendet, bei dem Stoffwechsel, Zellteilung und viele weitere zelluläre Prozesse beobachtet und verändert werden können. Weiterhin werden kultivierte Zellen als Testsysteme eingesetzt, beispielsweise bei der Untersuchung der Wirkung von Substanzen auf die Signaltransduktion und Toxizität der Zelle. Hierbei wird auch die Anzahl von Tierversuchen drastisch reduziert. Neue Gene können per Transfektion oder Transduktion in Zellen eingebracht werden. Mit einem Organ-on-a-Chip können Wechselwirkungen zwischen Zellen untersucht werden. Muskel- und Fettzellen werden in der Zellkultur zu In-vitro-Fleisch gezüchtet, um zu Lebensmitteln verarbeitet zu werden. Weiter Forschungsanwendungen umfassen unter anderem die Untersuchung der Selbsterneuerung von Stammzellen, Zellabstammung, Krebszellen, Fibrose, Funktion von Hepatozyten, und Mechanorezeptoren.
Die 3D-Zellkultur versucht im Zuge des Tissue Engineering Organoide oder künstliche Organe zu erzeugen. In der Pflanzenvermehrung erzeugt man bei der Pflanzlichen Gewebekultur aus Zellkulturen komplette Pflanzen.
Für die Herstellung von etlichen biotechnischen Produkten haben Zellkulturen von Säugerzellen ebenfalls hohe Bedeutung. Beispielsweise werden verschiedene Proteine, virale Vektoren und Viren für Impfstoffe hergestellt. Obwohl einfache Proteine mit weniger Aufwand auch in Bakterien oder Hefen produziert werden können, müssen glykosylierte Proteine in der Zellkultur in Säugerzellen hergestellt werden, da nur hier die korrekten Glykosylierungen der Proteine erfolgen. Für die Entwicklung und die Realisierung von industriellen Zellkulturprozessen werden Bioreaktoren eingesetzt, teilweise in Insektenzellkultur. Dabei sind für die Herstellung von biopharmazeutischen Produkten Einweg-Bioreaktoren von vermehrtem Interesse.
Geschichte mini|Alexis Carrel (1923) mini|FM-Aufnahme von konfluenten HeLa-Zellen mit Mikrotubuli (grün), Golgi-Apparat (orange) und Zellkern (blau)