Bürgerkrieg (1526–1538) Am 29. August 1526 erlitten die Truppen des Königreichs Ungarn eine vernichtende Niederlage von den Türken (dem Osmanischen Reich) bei Mohács, bei der auch der König Ludwig II. ums Leben kam. Einen Tag später flüchtete seine Frau Maria sowie der königliche Hof aus Buda/Ofen nach Pressburg (heute Bratislava). Die riesige eintägige Schlacht gilt in der Geschichte der Slowakei als die Grenze zwischen dem Mittelalter und der Neuzeit.
Im November 1526 hat eine Gruppe der Adeligen Johann Zápolya durch den slowakischen Bischof Štefan Podmanický aus Nitra/Neutra zum König krönen lassen. Johann Zapolya war der reichste Adlige des Königreichs, Herzog von Siebenbürgen, und er besaß riesige Besitztümer auch in der Slowakei. Im Dezember desselben Jahres hat allerdings eine andere Gruppe den Habsburger Ferdinand I., den Bruder von Maria, zum König gewählt und ein Jahr später vom selben Bischof krönen lassen. 1527–1538 folgte ein Bürgerkrieg, in dem die Anhänger der beiden Gegenkönige gegeneinander kämpften und der sich sehr oft in der Slowakei [v. a. südwestliche Slowakei, Bergbaustädte] abspielte. 1528 wurde dabei Johann Zapolya ein Vasall und Verbündeter der Osmanen. Nach dem Frieden von Oradea/Großwardein von 1538 blieb Zapolya die Ostslowakei, die Karpatoukraine und Siebenbürgen und Ferdinand die übrige Slowakei sowie die von den Türken noch nicht in der Zwischenzeit besetzten Gebiete des Königreichs Ungarn (d. h. West- und Mittelslowakei, Burgenland, Kroatien). Außerdem wurde vereinbart, dass die Habsburger die Gebiete von Zapolya nach dessen Tod erhalten werden.
Zerfall des Königreichs Ungarn und Reformation (1540–1604) Nach dem Tod von Zapolya im Jahre 1540 haben die Anhänger Zapolyas den Frieden von Oradea/Großwardein gebrochen und Johann Zapolyas Sohn Johann Sigismund statt Ferdinand I. zum König gewählt. 1541 eroberten die Türken Buda/Ofen und das Königreich Ungarn zerfiel bis zum Ende des 17. Jahrhunderts definitiv in drei Teile:
Das habsburgische „Königliche Ungarn“ (faktisch eine habsburgische Provinz): die heutige Slowakei (bis auf türkische Gebiete in der südlichsten Mittelslowakei) + ein kleiner Teil des nordöstlichen heutigen Ungarns sowie Burgenland und West-Kroatien. Es waren alles Gebiete die fast ausschließlich von Nicht-Magyaren (Deutschen und Slawen) bewohnt wurden. Siebenbürgen im heutigen West-Rumänien (in der Folge zeitweise bis zur Ostslowakei ausgeweitet), das ein türkischer Vasall und später die Ausgangsbasis für die anti-habsburgischen Aufstände (siehe weiter) in der Slowakei war Die türkische Provinz im heutigen Ungarn, die ein direkter Bestandteil des Osmanischen Reiches war.
1543 eroberten die Türken auch Esztergom/Gran, wodurch die türkische Grenze zum ersten Mal die heutige Slowakei erreichte. Esztergom/Gran wurde zur Ausgangsbasis für türkische Feldzüge in die angrenzende habsburgische Slowakei. Ein türkischer Feldzug von 1552 leitete im Prinzip einen langen türkisch-habsburgischen Krieg ein, der mit Unterbrechungen bis 1568 (Frieden von Edirne) dauerte. Hierbei eroberten die Türken 1552–1554 auch weitere Gebiete in der südlichen Mittelslowakei – die Gebiete um die Städte Šahy, Ďarmoty, Szécsény, Fiľakovo und Šalgovo. Von Fiľakovo aus plünderten die Türken zudem oft in den slowakischen Bergbaustädten sowie in der Zips. Im Prinzip aber änderten sich die türkisch-habsburgischen Grenzen in der Slowakei ständig. In den türkisch-habsburgischen Grenzgebieten mussten die Bewohner (auch noch im 17. Jahrhundert) die Drangsal und die Plünderungen beider Seiten ertragen.
1568 bis 1592 folgte eine verhältnismäßig ruhige Periode. In den 1570er Jahren wurde die heutige Stadt Nové Zámky/Neuhäusel als eine völlig neue Grenzfestung gebaut.
Obwohl die Slowakei formal Bestandteil von Ungarn blieb, gingen am Anfang des 16. Jahrhunderts mit der türkischen Eroberung des heutigen Ungarns mehr als 400 Jahre magyarisch geprägter Politik zu Ende und es setzte sich vom Haus Habsburg bestimmte Politik durch. So hatte beispielsweise 1531–1848 in Pressburg die von Kaiser Ferdinand gegründete Ungarische Kammer, die oberste Wirtschafts- und Verwaltungsbehörde, ihren Sitz. Parallel zur Besetzung des heutigen Ungarns durch die Türken wurden auch sämtliche Institutionen des Königreichs in die Slowakei umgesiedelt. Bereits im August 1526 flüchtete der königliche Hof nach Pressburg. 1529 flüchteten auch die ungarischen Zentralbehörden nach Pressburg. 1536 wurde Pressburg schließlich vom ungarischen Landtag zur Haupt- und Krönungsstadt Ungarns erklärt. Die Zentralbehörden blieben in Pressburg bis 1784, Krönungen ungarischer Könige fanden hier von 1563 bis 1830 statt und die Sitzungen des ungarischen Landtags wurden hier von 1542 bis 1848 abgehalten. Der ungarische Landtag wurde allerdings einige Male auch in anderen slowakischen Städten abgehalten (z. B. 1543 in Banská Bystrica/Neusohl). 1541–1820 war zudem Trnava/Tyrnau Sitz des Erzbistums von Esztergom/Gran, das 1543 von den Türken erobert wurde, und wurde so zum Zentrum der Kirche und der Gegenreformation im Königlichen Ungarn.
Die türkische Eroberung des heutigen Ungarns führte auch zu einer Änderung der ethnischen Struktur der Slowakei.
1547 wurde das Königliche Ungarn vor allem für militärische Zwecke in zwei Grenzoberhauptmannschaften (Grenzgeneralate; slowakisch kapitanáty) aufgeteilt. Das eine war die Slowakei, das andere die restlichen Gebiete. Von 1563 bis 1686 war dann das Gebiet der Slowakei in 2 Grenzoberhauptmannschaften geteilt – „Zisdanubien und Bergbaustädte“ in der West- und Mittelslowakei und „Oberungarn“ in der Ostslowakei sowie in kleinen Teilen des nordöstlichen heutigen Ungarns und der Karpatoukraine. Bis etwa zum Ende des 17. Jahrhunderts bezeichnete dann der Begriff Oberungarn die Ostslowakei und die angrenzenden Gebiete, und Niederungarn die restliche Slowakei und das restliche Königliche Ungarn.
Bereits 1521 in der Slowakei aufgetaucht, konnte sich die Reformation in den kriegerischen Jahren um die Mitte des 16. Jahrhunderts in der Slowakei schnell ausbreiten. Nachdem der Landtag zu Pressburg 1548 strenge Vorschriften vor allem gegen die radikal-reformatorische Täuferbewegung (in der Slowakei in Form der Hutterer bzw. Habaner) und Calvinisten verabschiedet hatte, wurden in der Slowakei nach dem Vorbild der Confessio Augustana drei Bekenntnisschriften (gemäßigte protestantische „Religionen“) aufgestellt, um Vorwürfe der Ketzerei zu verhindern: 1549 verfasste Leonhard Stöckel aus Bardejov/Bartfeld die Confessio Pentapolitana für die Städte der Pentapolitana, 1559 folgte die Confessio Heptapolitana (oder Montana) für die Städte der Heptapolitana und 1569 die Confessio Scepusiana der Zipser Städte. Am Ende des 16. Jahrhunderts waren die slowakischen und deutschen Protestanten meistens Anhänger der Augsburger Konfession von Martin Luther, während die Magyaren unter dem Einfluss von Matthias Dévay weitgehend Calvinisten wurden. 1562 wurden die ersten Jesuiten, die Vorboten der Gegenreformation, vom Erzbischof Mikuláš Oláh in die Slowakei eingeladen. Das 1581 in Bardejov/Bartfeld erschienene Buch Luthers Katechismus war das erste gedruckte Buch in slowakischer Sprache.
15-jähriger Krieg (1593–1606) und Aufstand von Stephan Bocskay (1604–1606) Nach einer Wirtschaftskrise im Osmanischen Reich brach 1593 ein weiterer Krieg gegen die Türken (1593–1606) aus. Er wird als der 15-jährige oder als der Lange Krieg bezeichnet. In seiner letzten Phase deckte er sich mit dem antihabsburgischen Aufstand von Stephan Bocskay (1604–1606). Bezüglich des Gebiets der Slowakei gab es neben Grenzverschiebungen vor allem Verwüstungen seitens der Türken im Jahre 1599 in weiten Gebieten der West – und Mittelslowakei, wobei sie auch Tausende von Menschen entführten.
miniatur|hochkant=2.0|Bocskay-Aufstand (1604–1606)
1604 brach allerdings in der Slowakei der antihabsburgische Aufstand von Stephan Bocskay aus, der den Türken half, Gebiete, die sie bisher im 15-jährigen Krieg verloren hatten, zurückzugewinnen (z. B. 1604 Pest, 1605 Esztergom/Gran). Der Aufstand von Stephan Bocskay (1604–1606) war der erste aus einer Serie von antihabsburgischen Aufständen, die sich im folgenden Jahrhundert (bis auf den letzten) fast ausschließlich in der Slowakei abspielten (1604–1711). Gemeinsame Charakteristika der Aufstände waren, dass sie gegen die Habsburger, gegen die Gegenreformation und gegen Wiener Zentralismus gerichtet waren, und dass sie in der Regel von den Osmanen (Türken) unterstützt wurden. Jeder von ihnen hatte aber darüber hinaus auch ganz spezifische Ursachen. 1604 eroberte Bocskay nach einigen Kämpfen im Herbst die Ostslowakei, bis Oktober 1605 eroberte er, von den Türken und slowakischen Adeligen unterstützt, die gesamte Slowakei, bis auf Pressburg. Im Sommer 1605 versuchte er sogar nach Mähren und Österreich vorzudringen.
1606 wurde der 15-jährige Krieg und der Aufstand durch einen bei Hurbanovo unterzeichneten Frieden beendet (Friedensverlängerungen erfolgten 1615, 1618, 1625, 1627, 1650), der u. a. Ungarn Religionsfreiheit gab. Während der anschließenden Friedensperiode wurde entsprechend 1607 in Pressburg das Evangelische Lyzeum gegründet, das später in der Geschichte der Slowaken eine wichtige Rolle spielte, und 1609 wurde der Slowake Juraj Turzo (Georg Thurzo), ein großer Förderer der Protestanten und der Slowaken, zum Palatin gewählt. Die 1606 neu gewonnene Religionsfreiheit war aber schnell wieder zu Ende, da sich die Gegenreformation erfolgreich durchsetzte. Bereits 1611 verabschiedete die vom slowakischen Erzbischof František Forgáč veranstaltete katholische Synode von Trnava/Tyrnau Maßnahmen für eine intensive Gegenreformation. 1616 wurde ein Ungar, der Jesuit Peter Pázmaň (Pazmány), der später 1623 das Pasmaneum in Wien gründete, zum Erzbischof von Trnava ernannt. Seine Ernennung bedeutete das definitive Ende der Reformation in der Slowakei. So wurden zum Beispiel auch die Bruderhöfe der täuferischen Hutterer zerschlagen. Seit dem 19. Jahrhundert ist die Slowakei wieder ein überwiegend katholisches Land.
Aufstände von Gabriel Bethlen (1619–1626) und Georg I. Rákóczi (1644–1645), erster Türkenkrieg (1663–1664) Gabriel Bethlen, seit 1615 der Fürst von Siebenbürgen, nutzte die Beschäftigung der Habsburger mit dem antihabsburgischen Aufstand in Tschechien (1618–1620) aus und griff das habsburgische Gebiet (d. h. die heutige Slowakei) 1619 massiv an. Bethlens erster Feldzug in die Slowakei fand 1619 bis 1621 statt. Seine von Georg I. Rákóczi geleiteten Truppen beherrschten im Oktober 1619 die gesamte heutige Slowakei einschließlich Pressburg. In Pressburg wurde ihm sogar vom Palatin die ungarische Krone überreicht. Zusammen mit böhmischen und mährischen Truppen ist es ihm dann aber nicht gelungen, auch Wien zu erobern. An den von Bethlen einberufenen Landtagen wurde u. a. eine allgemeine Religionsfreiheit erklärt (1619, Pressburg), Bethlen zum „Fürsten“ von Ungarn (1620, Bratislava) und zum König gewählt – wobei er allerdings eine Krönung ablehnte – (1620, Banská Bystrica/Neusohl). Nach der Niederlage der Tschechen am Weißen Berg wurden die Habsburger 1621 auch im Kampf gegen Bethlen erfolgreich (z. B. Eroberung von Bratislava und Nitra in Mai). Im Dezember 1621 verzichtete Bethlen schließlich im Frieden von Mikulov/Nikolsburg auf die eroberten Gebiete und auf den Königstitel und er (und damit auch Siebenbürgen) erhielt bis zu seinem Tod zwei Fürstentümer in Schlesien sowie sieben ostslowakische Komitate. Außerdem wurde die Religionsfreiheit bestätigt.