Endotheliale Stickstoffmonoxid-Synthase

Das Protein endotheliale Stickstoffmonoxid-Synthase (eNOS) gehört zur Enzymfamilie der NO-Synthasen. Es katalysiert die Bildung von Stickstoffmonoxid aus der Aminosäure L-Arginin.

Im Menschen wird eNOS vornehmlich in Endothelzellen gebildet, welche die innerste Zellschicht in Blut- und Lymphgefäßen darstellen. Dort spielen eNOS und Stickstoffmonoxid bei der Regulation des Blutdruckes und für die Funktion von Blutgefäßen eine zentrale Rolle. Verringerte Aktivität oder eine Fehlfunktion der eNOS begünstigen die Entstehung von Gefäßerkrankungen wie Atherosklerose. Besonders wichtig ist dabei das Phänomen der eNOS-Entkopplung. Entkoppelte eNOS produziert Superoxid an Stelle von Stickstoffmonoxid, fördert dadurch oxidativen Stress im Endothel und schadet so Blutgefäßen mehr als ihnen zu nützen. Aufgrund dieser Doppelfunktion wird eNOS auch als ein janusköpfiges Enzym bezeichnet.U. Förstermann: Janus-faced role of endothelial NO synthase in vascular disease: uncoupling of oxygen reduction from NO synthesis and its pharmacological reversal. In: Biological Chemistry, 387 (12), 2006, S. 1521–1533, doi:10.1515/BC.2006.190, PMID 17132097.

Entdeckung der eNOS

1980 entdeckte Robert Francis Furchgott, dass der bekannte Vasodilator Acetylcholin nur dann zur Erschlaffung von Blutgefäßen führt, wenn in diesen die Endothelzellschicht intakt ist. Er schloss daraus, dass Acetylcholin in Endothelzellen die Freisetzung einer unbekannten Substanz bewirkt, die für diese Wirkung verantwortlich ist.R. F. Furchgott, J. V. Zawadzki: The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine. In: Nature, 288 (5789), 1980, S. 373–376, doi:10.1038/288373a0. Diese Substanz wurde 1987 als Stickstoffmonoxid identifiziert.R. M. Palmer, A. G. Ferrige, Salvador Moncada: Nitric oxide release accounts for the biological activity of endothelium-derived relaxing factor. In: Nature, 327 (6122), 1987, S. 524–526, doi:10.1038/327524a0. Zwei Jahre später (1989) entdeckten Robert Palmer und Salvador Moncada das dafür verantwortliche Enzym.R. M. Palmer, Salvador Moncada: A novel citrulline-forming enzyme implicated in the formation of nitric oxide by vascular endothelial cells. In: Biochemical and Biophysical Research Communications, 158 (1), 1989, S. 348–352, PMID 2912454. Die Bezeichnung „endotheliale NOSynthase“ (eNOS) dient der Unterscheidung von den anderen Isoformen iNOS (induzierbare NO-Synthase) und nNOS (neuronale NO-Synthase).K. M. Naseem: The role of nitric oxide in cardiovascular diseases. In: Mol Aspects Med, 26 (1–2), 2005, S. 33–65, PMID 15722114.

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Physiologische Bedeutung Wirkungen von Stickstoffmonoxid in Blutgefäßen

→ Stickstoffmonoxid#Physiologische Bedeutung

Der von eNOS produzierte Botenstoff Stickstoffmonoxid (NO) übt zahlreiche positive Wirkungen in Blutgefäßen aus und gilt daher als gefäßschützender Faktor. Die wichtigsten physiologischen Wirkungen von Stickstoffmonoxid in Blutgefäßen sind:

Stickstoffmonoxid aktiviert das Enzym lösliche Guanylatcyclase, welches durch Bildung des Botenstoffes cyclisches Guanosinmonophosphat (cGMP) die Erschlaffung der glatten Gefäßmuskelzellen auslöst. Auf diese Weise ist eNOS an der Regulation des Blutdrucks beteiligt. Stickstoffmonoxid hemmt die Bildung von Adhäsionsmolekülen auf der Oberfläche von Endothelzellen. Dies hemmt die Anheftung von Leukozyten, einen der ersten Schritte bei der Entstehung von Atherosklerose. Stickstoffmonoxid hemmt die Oxidation von Low Density Lipoprotein (LDL). Die Aufnahme von oxidiertem LDL durch Fresszellen trägt ebenfalls zur Entwicklung von Atherosklerose bei. Stickstoffmonoxid hemmt die Zusammenlagerung von Blutplättchen (Thrombozytenaggregation) und damit die Bildung von Blutgerinnseln, die Blutgefäße verstopfen können (siehe auch: Herzinfarkt). Stickstoffmonoxid unterdrückt die abnormale Zellteilung glatter Gefäßmuskelzellen, ein Prozess, der zur Verengung von Blutgefäßen beiträgt (siehe auch: Restenose).

Die vielen Gefäßschützenden Eigenschaften von Stickstoffmonoxid machen deutlich, dass eine Verringerung der Stickstoffmonoxid-Produktion von eNOS die Entstehung von Gefäßerkrankungen begünstigt.

eNOS-Entkopplung

Der Begriff eNOS-Entkopplung beschreibt einen Zustand, bei dem eNOS Superoxid an Stelle von Stickstoffmonoxid produziert. In diesem Fall ist die enzymatische Reduktion des Sauerstoffes von der katalytischen Reaktion mit L-Arginin entkoppelt. Der Zustand tritt vor allem dann ein, wenn zu wenig des Kofaktors Tetrahydrobiopterin (BH4) im Endothel vorhanden ist (siehe auch: katalytischer Mechanismus der eNOS).

Das von entkoppelter eNOS gebildete Superoxid reagiert sehr leicht mit Stickstoffmonoxid zu Peroxynitrit. Peroxynitrit wiederum baut BH4 ab, wodurch eNOS in einem Teufelskreis immer stärker entkoppelt wird. Dies erhöht den oxidativen Stress in Blutgefäßen und bildet eine wichtige Grundlage für die Entstehung von Bluthochdruck, Atherosklerose und anderen Herz-Kreislauferkrankungen. Unter diesen Umständen wandelt sich eNOS von einem Gefäßschützenden zu einem Gefäßschädigenden Enzym um. Man spricht in diesem Zusammenhang auch von einer endothelialen Dysfunktion.

Das Phänomen der eNOS-Entkopplung ist auch der Grund dafür, dass die Erhöhung der endothelialen eNOS-Expression nicht zwangsläufig dazu führt, dass auch mehr Stickstoffmonoxid im Gefäß gebildet wird. Dies ist nur dann der Fall, wenn auch die entsprechende Menge BH4 zur Verfügung steht.

Einem BH4-Mangel im Endothel kann grundsätzlich auf zwei Arten begegnet werden: Entweder versucht man, die BH4-Bildung zu erhöhen oder BH4 vor Abbau zu schützen. Arzneistoffe aus der Gruppe der Statine können beispielsweise die Expression des BH4-produzierenden Enzyms GTP-Cyclohydrolase I (GTPCH I) steigern. Dadurch erhöhen sie die BH4-Konzentration in Endothelzellen und verbessern die eNOS-Funktion.Y. Hattori, N. Nakanishi, K. Akimoto, M. Yoshida, K. Kasai: HMG-CoA reductase inhibitor increases GTP cyclohydrolase I mRNA and tetrahydrobiopterin in vascular endothelial cells. In: Arterioscler Thromb Vasc Biol, 23 (2), 2003, S. 176–182, PMID 12588756. Ascorbinsäure (Vitamin-C) stabilisiert BH4 chemisch und hemmt dessen Abbau durch oxidativen Stress.R. Heller, A. Unbehaun, B. Schellenberg, B. Mayer, G. Werner-Felmayer, E. R. Werner: l-Ascorbic Acid Potentiates Endothelial Nitric Oxide Synthesis via a Chemical Stabilization of Tetrahydrobiopterin. In: Journal of Biological Chemistry, 276 (1), 2001, S. 40–47, doi:10.1074/jbc.M004392200, PMID 11022034. Verschiedene Blutdrucksenkende Arzneistoffe wie ACE-Hemmer und Angiotensin-Rezeptorblocker erhöhen die BH4-Konzentration im Endothel vermutlich durch Verringerung des oxidativen Stresses in Blutgefäßen.T. J. Guzik, D. G. Harrison: Vascular NADPH oxidases as drug targets for novel antioxidant strategies. In: Drug Discovery Today, 11 (11–12), 2006, S. 524–533, doi:10.1016/j.drudis.2006.04.003.

Struktur und Funktion der eNOS Chromosomale Lokalisation und Proteinstruktur

Im menschlichen Genom liegt das Gen NOS3, welches für die eNOS codiert, auf Chromosom 7 (7q35–36). Es umfasst 26 Exons und erstreckt sich über eine Länge von ca. 21 Kilobasen auf der DNA. Das eNOS Protein besitzt 1203 Aminosäuren mit einer Molekülmasse von 133 kDa. Strukturell unterteilt sich eNOS in zwei Proteindomänen mit unterschiedlicher katalytischer Aktivität: Am C-terminalen Ende befindet sich die Reduktase-Domäne. Darin liegen Bindungsstellen für die Kofaktoren Nicotinsäureamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat (NADP), Flavin-Adenin-Dinukleotid (FAD) und Flavinmononukleotid (FMN). Die Oxygenase-Domäne am N-Terminus enthält eine Hämgruppe sowie Bindungstellen für Sauerstoff und den Kofaktor Tetrahydrobiopterin (BH4). Beide Untereinheiten werden über ein Bindungsmotiv für das Protein Calmodulin miteinander verbunden.W. K. Alderton, C. E. Cooper, R. G. Knowles: Nitric oxide synthases: structure, function and inhibition. In: Biochem J, 357 (Pt 3), 2001, S. 593–615, PMID 11463332; PDF. Um katalytisch aktiv zu sein, müssen sich zwei eNOS-Proteine zu einem Homodimer zusammenlagern. Darin bildet die Oxygenase-Domäne des einen Monomers mit der Reduktase-Domäne des jeweils anderen eine funktionelle Einheit. Zur Stabilisierung des Proteinkomplexes dient ein Zinkion, das mit zwei Cystein-Resten jedes Monomers tetraedrisch komplexiert ist. Zumeist ist auch noch Calmodulin an das Homodimer gebunden, so dass ein solcher eNOS-Proteinkomplex – streng genommen – ein Tetramer darstellt.

Katalytischer Mechanismus und Rolle der Kofaktoren

Bei der von eNOS katalysierten Reaktion wird die Guanidin-Gruppe der Aminosäure L-Arginin in Gegenwart von Sauerstoff oxidiert. Dabei entstehen die beiden Produkte Stickstoffmonoxid (NO) und L-Citrullin in gleichen Mengen.

Im ersten Reaktionsschritt wird an der Reduktase-Domäne ein Elektron von NADPH abgespalten. Anschließend wird dieses Elektron mit Hilfe der Kofaktoren FAD, FMN und Calmodulin zur Oxygenase-Domäne weitergeleitet. Im katalytischen Zentrum steht molekularer Sauerstoff durch Bindung an das Eisenatom der Hämgruppe als Elektronenempfänger zur Verfügung. In der Folge wird Sauerstoff reduziert und reagiert mit dem Kohlenstoffatom der Guanidin-Gruppe im Substrat L-Arginin. So entsteht zunächst das Zwischenprodukt Nώ-Hydroxy-L-Arginin. In einem zweiten Durchgang dient Nώ-Hydroxy-L-Arginin als Substrat und wird in L-Citrullin umgewandelt. Dabei wird ein Stickstoffatom der Guanidin-Gruppe abgespalten und als NO freigesetzt.

Die Stöchiometrie der Reaktion lautet:

2 L-Arginin + 3 NADPH + 4 O2 → 2 L-Citrullin + 3 NADP+ 4 H2O + 2 NO

Zudem spielt BH4 als Kofaktor eine wichtige Rolle. Ein Mangel an BH4 führt dazu, dass die enzymatische Reduktion des Sauerstoffes von der katalytischen Reaktion mit L-Arginin entkoppelt wird. In diesem Fall zerfällt der Sauerstoff-Häm-Komplex und es entsteht ein Superoxid-Radikal an Stelle von NO. Diese eNOS Entkopplung spielt bei der Entstehung von Herz-Kreislauferkrankungen eine zentrale Rolle.

Subzelluläre Lokalisierung

Die Verteilung von eNOS innerhalb der Zelle wird vor allem durch am Enzym angebrachte Fettsäuren, so genannte Lipid-Anker, bestimmt. Dadurch wird eNOS gezielt an bestimmte Stellen der Zellmembran, den Caveolae, transportiert. Caveolae sind Einbuchtungen der Zellmembran mit einer typischen Zusammensetzung aus Lipiden und Proteinen. Häufig finden sich dort Ansammlungen funktionell verknüpfter Proteine. In Caveolae kommen verschiedene Proteine vor, welche die eNOS-Aktivität beeinflussen können. Dazu gehören Caveolin-1, Proteinkinase B (AKT), das Hitzeschockprotein Hsp90, G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (siehe: eNOS-Regulation durch Protein-Protein Interaktionen).P. W. Shaul: Endothelial nitric oxide synthase, caveolae and the development of atherosclerosis. In: J Physiol, 547 (Pt 1), 2003, S. 21–33, PMID 12562964, doi:10.1113/jphysiol.2002.031534.

Zudem kann eine eNOS-Aktivierung zu deren Umverteilung innerhalb der Zelle führen. So bewirken die eNOS-Agonisten Acetylcholin, Bradykinin oder Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) die Entfernung von Fettsäureresten und eine Verlagerung von eNOS-Protein in den Golgi-Apparat. Des Weiteren beeinflusst die Bindung von Stickstoffmonoxid an bestimmte eNOS Cystein-Reste, so genannte S-Nitrosylierungen, den Aufenthaltsort des Proteins.Stefanie Oess, Ann Icking, David Fulton, Roland Govers, Werner Müller-Esterl: Subcellular targeting and trafficking of nitric oxide synthases. In: Biochemical Journal, 396 (3), 2006, S. 401–409, PMID 16722822, .