Feststoff-Bioreaktoren (englisch Solid State Fermentation-Bioreactors; SFB) sind Bioreaktoren, die zur Kultur von Mikroorganismen und zur industriellen Herstellung von Enzymen, Medikamenten und Nahrungsmitteln genutzt werden.
Probleme bei der Auslegung der Feststoff-Bioreaktoren ergeben sich durch die Limitierungen bei Sauerstoffversorgung sowie der Ventilation von überschüssigem CO2, die zu nicht tolerierbaren Temperaturgradienten, Austrocknen und der irreversibler Schädigung der Kultur führen.
Durch Beimengung geeigneter Füllkörper lässt sich die tolerierbare Schichtdicke und damit die Raum-Zeit-Ausbeute des Reaktors steigern.
Generell wird zwischen stationären und instationären Bioreaktoren unterschieden. Zu den stationären Reaktoren gehören unter anderem Petrischalen, Fernbach-Kolben, hölzerne Inkubatoren, der Covered Pan-Bioreaktor sowie Säulen-SSF-Bioreaktoren (englisch Solid State Fermentation, SSF, Feststoff-Fermentation). Zu den instationären Reaktoren zählt man die Rotary-Drum-SFB, der gerührte SFB sowie der Taumel-SFB.
Geschichte Während die Feststoff-Fermentation in den westlichen Ländern seit ihrer späten Entdeckung zu Anfang des 20. Jahrhunderts vernachlässigt wurde, erlebte sie in den fernöstlichen Ländern nach dem Zweiten Weltkrieg eine stetige Aufwärtsentwicklung hin zu vollautomatischen industriellen Prozessen mit einem geschätzten Marktvolumen von 8–10 Milliarden $/Jahr. Dabei ist die SSF nicht nur für die klassischen ostasiatischen Applikationen, wie der Herstellung von Enzymen und Nahrungs- und Würzmitteln von Interesse, sondern auch für
neuartige Antibiotika antikarzinogene Substanzen Antioxidantien Aromen Duftstoffe „Health Food“ hypocholesterinemische Agenzien Starterkulturen mit Proteinen angereichertes Tierfutter thrombolytische Enzyme vasoaktive Agenzien Vitamine etc.
Das klassische Verfahren zur Massenkultur von Schimmelpilzen durch SSF ist seit Jahrtausenden, vor allem in fernöstlichen Ländern, die stationäre Kultur in perforierten Tabletts, die wenige Zentimeter hoch mit dem beimpften Substrat befüllt werden.
In den ostasiatischen Ländern, vor allem Japan, erfolgte eine Maßstabsvergrößerung der SSF in den vollständig automatisierten industriellen Maßstab mit Kapazitäten von mehr als 100 t beimpftes Substrat pro SSF-Bioreaktor (SFB). Bei einer um den Faktor fünf bis sieben größeren Substratkapazität entspricht dies der Leistung eines Submers-Bioreaktors mit einem Arbeitsvolumen zwischen 700 und 1000 m³. Die Erkenntnis wesentlicher ökonomischer und verfahrenstechnischer Vorteile der SSF gegenüber der Submersfermentation (STF) führte, vor allem in den USA seit den siebziger Jahren, zu einer Wiederbelebung der Forschungsaktivitäten auf dem Gebiet der SSF.
Der Durchbruch zu einer großtechnischen Nutzung dieses vergleichsweise einfacheren und kostengünstigeren Verfahrens ist jedoch abhängig von der Verfügbarkeit automatisierter SSF-Bioreaktoren im industriellen Maßstab, das heißt, mit Kapazitäten oberhalb von 10 t an beimpftem Substrat.
Im Folgenden wird ein Überblick über die bis heute eingesetzten SSF-Bioreaktoren gegeben. Deren Einteilung erfolgt, je nachdem ob das inokulierte Substrat während der Fermentation bewegt wird oder nicht, in stationäre und instationäre Verfahren.
Stationäre SSF-Bioreaktoren Bei den stationären Verfahren der SSF wird das Substrat während der Fermentation entweder überhaupt nicht oder nur in der Mitte der Fermentation, ein- bis zweimal, umgewälzt.
Petrischalen miniatur|rechts|Petrischale mit Kultur
Petrischalen mit 20–30 g feuchtem Substrat in dünner Schicht sind der erste Schritt zur Kultivierung von Schimmelpilzen auf festen Substraten. Die Beimpfung erfolgt von einer Agarplatte durch Übertragung von sterilem Substrat auf die sporulierte Kultur. Die Platte wird zur gleichmäßigen Verteilung von Sporen und Luftmycel auf der Oberfläche der Substratpartikel geschüttelt. Die Petrischale wird unter geeigneten Bedingungen in Brutschränken bis zur Sporulation inkubiert. Der dicht durchwachsene, kompakte Kuchen wird getrocknet vermahlen und dient als Inokulum (die Menge an Zellen, mit denen ein Fermenter angeimpft wird), für die Anzucht in größeren, flachen Schalen mit zirka 200 g inokuliertem Substrat. Sämtliche Manipulationen erfolgen unter aseptischen Bedingungen. Diese Methode ist einfach, sicher und preiswert.
Fernbach-Kolben Fernbachkolben werden ausschließlich für SSF im kleinen Labormaßstab eingesetzt. So werden zum Beispiel 70 g Weizenkleie eingeweicht und mit Wattestopfen oder Kappen verschlossen. Die Kolben werden autoklaviert. Das Inokulum wird durch intensives Schütteln mit dem Substrat vermischt, die Kolben anschließend stationär inkubiert. Petrischalen und Fernbach-Kolben sind wegen des Fehlens einer Möglichkeit zur Belüftung, Befeuchtung, Entfernung von überschüssigem CO2 sowie wegen der daraus resultierenden geringen Substratkapazitäten nur für erste Schritte im Labor geeignet. Beide Methoden sind relativ arbeitsaufwändig und ungeeignet für ein Scale-up.
Hölzerne Inkubatoren Zur Steigerung der Substratkapazität wurden deshalb in den USA seit zirka 1938 und während des Zweiten Weltkriegs zur Herstellung von Aflatoxinproduktion im beabsichtigten großen Maßstab hölzerne Inkubatoren von 27 L Volumen zur Aufnahme von 4,5 kg Weizenkleie mit einer Schichtdicke von 25 cmHesseltine, C.W. (1977). Process Biochem. 12 Nr. 6, 24–27. entwickelt. Der Bioreaktor besaß Vorrichtungen für Be- und Entlüftung mit Umkehrung der Strömungsrichtung, Temperatur-, Druckanzeige sowie eine temperierbare Luftbefeuchtung.
Die mit diesen Bioreaktoren erhaltenen Ergebnisse waren schlechter als die in flacher Schicht. Die Ursachen waren ungleichmäßige Belüftung, Ventilation, Befeuchtung sowie Temperaturgradienten von 30 bis 50 °C infolge bevorzugter Strömungskanäle innerhalb der Packung. Die Ergebnisse wurden als Basis für weitere Entwicklungen angesehen. Versuche zum Scale-Up in den halbtechnischen Maßstab mit Substratkapazitäten bis 1 t ergaben noch mäßigere Ergebnisse. Immerhin war das Wachstum auf weitaus niedrigerem Niveau als in dünner Schicht, reproduzierbar.J. Takamine. Ind. Eng. Chem. 6, 1914, 824–828. Versuche zu einer Steigerung der Schichtdicke bei gleichzeitiger Verringerung des Durchmessers misslangen vollständig. Die Ergebnisse mit vergrößerten Schichtdicken waren so eindeutig negativ, die Ursachen für die Misserfolge so offenkundig, dass sich, rückschauend, bereits in den vierziger Jahren und erst recht später, weitere Versuche, die Kapazitätsrate durch Steigerung der Schichtdicke zu erhöhen, erübrigt hätten.
Covered Pan-Bioreactor (Pot Method) Zu Beginn der 1940er Jahre wurden große Mengen an Inokulum für die SSF in Rotary Drum Bioreaktoren benötigt. Alternativ zu den hölzernen Inkubatoren wurden geschlossene, flache Pfannen mit den Maßen 61 × 61 × 10 cm (Totalvolumen zirka 37 l) entwickelt. Die Luftzuführung erfolgte im Zentrum des Deckels, die Abluftausgänge in den vier Ecken nahmen ihren Ursprung aus der Tiefe der Substratpackung. Hierdurch sollte eine Zwangsdurchströmung des Substrates gewährleistet werden. Die Kapazität betrug zirka 4 kg inokuliertes Substrat. Die Schichtdicke durfte 1 cm nicht überschreiten, da ansonsten Sauerstofflimitierung stattfand. Die Kapazitätsrate (w/v) betrug weniger als 10 %. Diese Methode war der in rotierenden Drehtrommel-Bioreaktoren (Rotating Drum Bioreactors) überlegenLindenfelser, L.A., Ciegler, A. (1975). Appl. Microbiol. 29, 323–327., Wachstum, Enzymbildung und Sporulation waren weitaus intensiver. Die Einrichtung war weniger aufwändig zu betreiben als die Rotary Drum Bioreaktoren. Außerdem war das Mycel während des Wachstums nicht, wie in den Rotary Drum-Bioreaktoren, einer ständigen Scherbelastung unterworfen, die zu einer starken Verzögerung des Wachstums bei erheblich verlängerter Fermentationsdauer und signifikant verringerten Enzymausbeuten führte.
Eine kleinere Variante bestand aus einer runden Aluminium-Kasserolle (15 cm Durchmesser und 11,3 cm Höhe, Totalvolumen zirka 2 l), deren Boden perforiert war. Die Kapazität betrug zirka 750 g feuchte Weizenkleie (Kapazitätsrate 38 %, w/v). Der Bioreaktor besaß Vorrichtungen für Be- und Entlüftung, Umkehr der Strömungsrichtung und Temperaturkontrolle. Befeuchtung des Substrates, Sterilisation, Inokulation mit Aspergillus oryzae (0,6–1 %, w/w), Inkubation (30 °C) usw. wurden in situ durchgeführt. Belüftung, Ventilation von überschüssigem CO2, Befeuchtung und Temperierung wurden mit angefeuchteter, temperierter Luft durchgeführt. Vergleiche dieses Typs mit Rotary Drum-Bioreaktoren ergaben eine Reihe von Vorteilen für das stationäre Verfahren: weniger Platzbedarf, gleichmäßigeres Wachstum, besser reproduzierbare und höhere Enzym-Ausbeuten, Verzicht auf Vorrichtungen zur Umwälzung des fermentierenden Substrates. Auch hier wurde der negative Effekt der Scherbelastung in Rotary Drum-Bioreaktoren auf Wachstum, Ausbeute und Prozessdauer hervorgehoben. Ein Nachteil der Covered Pan Bioreactors war jedoch, dass diese Methode wegen ungleichmäßiger Belüftung bei Maßstabsvergrößerung nicht Scale-Up-fähig, zu arbeitsaufwändig und daher für die industrielle SSF nicht geeignet war.
SSF in flachen Tabletts (Shallow Layer Tray Method) Der traditionelle Koji-Prozess zur Produktion von Enzymen auf Sojabohnen in Japan verwendet flache Tabletts (Schichtdicke bis zirka 4 cm) aus Holz, Aluminium oder rostfreiem Stahl mit perforiertem Boden (Löcher mit zirka 3 mm Durchmesser in Abständen von zirka 2,5 cm), in denen das mit Aspergillus oryzae inokulierte Substrat zirka 3 Tage/30 °C inkubiert wird. Die Tabletts werden in klimatisierten Räumen übereinander mit lichten Abständen von zirka 10 cm gestapelt. Die Schichtdicke des inokulierten Substrates darf bei Kulturen mit einer Fermentationsdauer von mehr als 48 h 4 cm nicht überschreiten.
Bei rasch wachsenden Kulturen (15–24 h) liegt die maximale vernünftige Schichtdicke bei 2–3 cm. Bei höheren Schichtdicken wachsen die äußeren (oben und unten) 1–2 cm einwandfrei, während innerhalb davon die Temperaturen derart hohe Werte (bis zirka 57 °C) erreichen, dass das Mycel nach geringem anfänglichen Wachstum irreversibel inaktiviert wird und autolysiert. Tabletts für den Labor- und Pilot-Maßstab werden üblicherweise manuell gehandhabt. Sie haben daher aus Gewichtsgründen Abmessungen von zirka 50 × 60 × 2–4 cm³ (6–12 l Volumen) mit einer Substratkapazität von, je nach Schichtdicke, 4–8 kg inokuliertes Substrat. Bei Stahlblechen (18/10) beträgt das Gesamtgewicht nach Befüllung zwischen 8–12 kg. Tabletts für gewerbliche Produktion haben Abmessungen von zirka 150 × 500 × 2–4 cm³ (150–300 l Volumen) mit einer Kapazität bis zirka 200 kg inokuliertes Substrat. Diese Tabletts werden automatisch befüllt, entleert, gereinigt und sterilisiert. Nach Inokulation werden die Tabletts, zur Verbesserung der Ventilation vorzugsweise 10–15° geneigtKnapp, J.S., Howell, J.A. (1980). In: Topics in Enzyme and Fermentation Biotechnology, A. Wiseman, ed., vol. 4, S. 85–143, Ellis Horwood Ltd., Chichester. Vollbrecht, D. (1988). Forum Mikrobiol. 9, 386–394., in Stapeln mit, in Abhängigkeit von der Ventilation unterschiedlichen lichten vertikalen Abständen bis hinab auf 2 cm, übereinander angeordnet und unter definierten Bedingungen (Temperatur, Feuchtigkeit, Belüftung) inkubiert. Ungeachtet des gewünschten Produktes ist die Überwachung weiterer Faktoren in der Regel überflüssig. Der wesentliche Vorteil der Tablett-Methode sind ihre Einfachheit, Unanfälligkeit gegenüber Störungen, ausgezeichneten Ergebnisse und Reproduzierbarkeit. Die vollautomatischen japanischen Anlagen, die zum Teil seit den sechziger Jahren in Betrieb sind, besitzen Kapazitäten von zirka 30 bis zu einigen hundert t Substrat pro Tag mit kontinuierlicher Prozessführung.
Moderner SSF-Bioreaktor im Pilot-Maßstab