mini|Zeitraffer einer Dünnschichtchromatografie eines Pigmentfiltrats des Gemeinen Efeus (Hedera Helix L.) mini|DC eines Farbstoffgemisches aus einem Permanentmarker Die Dünnschichtchromatographie bzw. -chromatografie (DC oder TLC, ) ist ein physikalisch-chemisches Trennverfahren, das zur Untersuchung der Zusammensetzung von Proben genutzt wird. Besonders vorteilhaft bei dieser chromatographischen Methode ist der geringe apparative Aufwand, die Schnelligkeit, die hohe Trennleistung und der geringe Substanzbedarf. Eingesetzt wird sie zum Beispiel zum raschen Nachweis der Reinheit einer Substanz oder der Überprüfung der Identität mit einer Referenzsubstanz. Auch die Verfolgung des Reaktionsverlaufes von chemischen Umsetzungen im Labor ist mit wenig Aufwand möglich.
Geschichte N. A. Izmailov und M. S. Shraiber, zwei russische Forscher, führten 1938 eine chromatographische Trennung mit einer horizontalen Dünnschichtplatte durch, auf die sie das Lösemittel auftropften. Doch ihre Methode wurde kaum beachtet. Erst als Justus G. Kirchner (1911–1987) am Fruit and Vegetable Laboratory des US-Landwirtschaftsministeriums in Südkalifornien und seine Mitarbeiter (darunter auch B. Harnischmacher) sich ab 1951 mit ihr befassten, wurde das Interesse anderer an der Methode geweckt. Zum Durchbruch verhalf ihr Egon Stahl, als er die Herstellung von leistungsfähigen Platten beschrieb. Von ihm stammt auch der Name Dünnschichtchromatographie.Joseph C. Touchstone: Practice of Thin Layer Chromatography. 3. Auflage. Wiley, New York NY u. a. 1992, ISBN 0-471-61222-7, S. 3–4.
Theoretische Grundlagen Grundprinzip der chromatographischen Trennung Das Grundprinzip der Chromatographie gilt für alle chromatographischen Methoden und kann wie folgt kurz zusammengefasst werden: Zu analysierende Teilchen (Moleküle, Ionen) verteilen sich auf zwei Phasen in einem für die Teilchensorte charakteristischen Verhältnis. Wie das Verhältnis mit der Teilchensorte variiert, ist auch abhängig von den physikalischen Eigenschaften der beiden Phasen. Die Verhältnisse stellen sich als dynamische Gleichgewichte ein (Diffusion aufgrund der Wärmebewegung) und werden in der Chromatographie durch die Bewegung einer mobilen gegen eine stationäre Phase in Geschwindigkeitsunterschiede verwandelt. Die Geschwindigkeit einer Teilchensorte ergibt sich aus dem Produkt der Geschwindigkeit der mobilen Phase mit dem Zeitanteil, den die Teilchen in der mobilen Phase verbringen. Es wird angenommen, dass die Teilchen in der mobilen Phase (statistisch gesehen) dieselbe Geschwindigkeit haben wie die Laufmittelmoleküle. Sind sie an die stationäre Phase gebunden, ist die Geschwindigkeit gleich Null („stop and go“-Modell).
Bei geringen Verteilungsunterschieden noch eine Auftrennung zu erzielen, ist nicht nur eine Frage der Länge der Wegstrecke; entscheidend ist auch, dass die Teilchen sehr oft zwischen den Phasen wechseln. Dann gilt das Gesetz der großen Zahl und es entspricht der Zeitanteil, den das individuelle Teilchen in der mobilen bzw. der stationären Phase zubringt, genau dem Anteil der Teilchen dieser Sorte in den beiden Phasen.
Die DC zählt zu den flüssigchromatographischen Methoden. Damit lassen sich alle Proben, die ausreichend stabil sind und in Lösung gebracht werden können, untersuchen. Bei der DC wandert ein Lösungsmittel durch Kapillarkräfte in einem festen, feinporigen Trägermaterial (z. B. Kieselgel) aufwärts.
Stationäre Phase Die stationäre Phase (Trennschicht) besteht aus einer dünnen Schicht eines sehr feinkörnigen Materials (z. B. Kieselgel, Kieselgur, Aluminiumoxid, Cellulose). Diese Trennschicht ist sehr gleichmäßig auf eine Trägerfolie oder Trägerplatte aus Kunststoff, Aluminiumblech oder Glas aufgetragen und kommerziell in unterschiedlichen Schichtdicken erhältlich. In der Regel kommt als stationäre Phase Kieselgel zum Einsatz (Normalphasenchromatographie), das aufgrund der freien endständigen Hydroxygruppen als polares Adsorbens für die Probenmoleküle dient. Der mittlere Porendurchmesser der Kieselgele beträgt meist 4 bis 100 nm, wobei der Porendurchmesser von 6 nm (Kieselgel 60, Merck) am gebräuchlichsten ist. Kieselgele enthalten Siloxan- oder Silanol-Gruppen.
Alternativ dazu kommen auch DC-Materialien mit anderen funktionellen Gruppen (z. B. Aminogruppen) zum Einsatz. Sie unterscheiden sich vom Standard-Kieselgel nicht nur in ihrer Polarität, sondern auch in der Basizität und führen damit zu völlig anderen Trennergebnissen. Auch oberflächenmodifizierte Kieselgele mit unpolaren Haftstellen (durch Kupplung mit Organochlorsilanen) werden eingesetzt (Umkehrphasenchromatographie, ). Die Reihenfolge, in der die verschiedenen Probemoleküle aufgetrennt werden, kehrt sich dann um – die polaren Moleküle laufen schneller, die unpolaren Moleküle werden stärker festgehalten. Vorteilhaft ist dabei unter anderem, dass auch sehr polare Proben untersucht werden können. Als weitere stationäre Phasen für die DC eignen sich auch Aluminiumoxid, Magnesiumsilikat, Kieselgur, Polyamid, Cellulose.
Die Trennung von geometrischen und Positions-Isomeren mit Doppelbindungen gelingt mittels Silbernitrat-DünnschichtchromatographieBeate Breuer, Thomas Stuhlfauth, Heinrich P. Fock: Separation of fatty acids or methyl esters including positional and geometric isomers by alumina argentation thin-layer chromatography. In: Journal of Chromatographic Science. Band 25, Nr. 7, 1987, , S. 302–306, doi:10.1093/chromsci/25.7.302.. Zur Trennung chiraler Proben werden reversed phase-DC-Platten eingesetzt, die mit dem Kupfer-Komplex eines chiralen DerivatesKurt Günther, Jürgen Martens, Maren Schickedanz: Dünnschichtchromatographische Enantiomerentrennung mittels Ligandenaustausch. In: Angewandte Chemie. Band 96, 1984, S. 514–515, doi:10.1002/ange.19840960724. der Aminosäure L-Prolin beschichtet sind und die direkte dünnschichtchromatographische Trennung von Enantiomeren nach dem Prinzip der chiralen Ligandenaustauschchromatographie erlauben.Kurt Günther: Thin-layer chromatographic enantiomeric resolution via ligand exchange. In: Journal of Chromatography A. Band 448, 1988, S. 11–30, doi:10.1016/S0021-9673(01)84562-3.Kurt Günther, Maren Schickedanz, Jürgen Martens: Thin-Layer Chromatographic Enantiomeric Resolution. In: Naturwissenschaften. Band 72, Nr. 3, 1985, S. 149–150, doi:10.1007/BF00490403.Teresa Kowalska, Joseph Sherma (Hrsg.): Thin Layer Chromatography in Chiral Separations and Analysis (= Chromatographic Science. Band 98). CRC Press Taylor & Francis Group, Boca Raton FL 2007, ISBN 978-0-8493-4369-8.
Für spezielle Anwendungen kann auch das „Waschen“ der Platte vor dem Auftragen der Probe oder auch das Trocknen im Exsikkator oder Trockenschrank bei erhöhter Temperatur notwendig sein. Gewaschen werden die Platten durch Einstellen in eine Chromatographiekammer mit dem entsprechenden Lösungsmittel, bis die Fließmittelfront die Oberkante der Platte erreicht hat.
Mobile Phase Als Laufmittel werden in der Normalphasen-DC unpolare organische Lösungsmittel in der Regel als Gemisch mit mäßig polaren Lösungsmitteln genutzt (z. B. Petrolether und Essigsäureethylester); in der Umkehrphasen-DC dagegen polare Laufmittel (z. B. Acetonitril und Wasser). Über das Mischungsverhältnis kann man die Polarität des Fließmittels steuern.
Die Adsorptionskapazität von Kieselgel für die funktionellen Gruppen nimmt in der Folge –COOH > –OH > –NH2 > –SH > –CHO > R2C=O > CO2R > –OCH3 > –HC=CH– ab.
Organische Carbonsäuren oder Alkohole weisen also auf Kieselgel eine sehr hohe Adsorption und damit geringe RF-Werte auf. Bei einem wenig polaren Laufmittel können diese Substanzen möglicherweise am Startfleck verbleiben.
Trennstrecke Verschiedene Arten der Diffusion wirken einer guten Auftrennung entgegen. Entscheidend ist der rasche Wechsel der Teilchen zwischen den beiden Phasen. Daher ist es auch günstig, möglichst geringe Laufstrecken und feine, einheitliche Korngrößen des Schichtmaterials zu haben. Zu geringe und zu hohe Geschwindigkeiten der mobilen Phase wirken sich negativ aus. Eine zu geringe Geschwindigkeit begünstigt eine Vergrößerung der Zonen, in denen sich die Probemoleküle aufhalten. Je mehr Zeit zur Verfügung steht, desto größer ist die Rolle, die Diffusionsprozesse innerhalb der mobilen Phase spielen. Ist die Geschwindigkeit zu hoch, kommt es seltener zu einem Wechsel der Teilchen zwischen der mobilen und der stationären Phase. Das führt zu einer größeren statistischen Streuung und ist ebenfalls unerwünscht. Bei allen chromatographischen Methoden gibt es entsprechend eine optimale Geschwindigkeit der mobilen Phase, die durch die Van-Deemter-Gleichung beschrieben wird. Je feiner die Korngrößen sind (bzw. die Dimensionen), desto höher kann die Geschwindigkeit werden. Daraus folgen auch ökonomische Vorteile.
Bei der DC ist die erwünschte räumliche Auftrennung zwischen den verschiedenen Probekomponenten der gesamten Laufstrecke proportional (Abstand Startlinie – Laufmittelfront). Die Vergrößerung der einzelnen Zonen auf Grund statistischer Effekte ist geringer (nicht der Laufstrecke proportional, sondern der Wurzel der Laufstrecke). Daher ist es bei schwierigen Trennungen sinnvoll, größere DC-Folien und Laufstrecken zu verwenden.
Mit der Dünnschichtchromatographie lässt sich auf einer 15 cm langen Laufstrecke eine Trennleistung von ca. 400–3000 theoretischen Böden erzielen.
Praktische Durchführung Probenauftrag mini|hochkant=0.5|Glaskapillaren mit Ringmarke Die zu untersuchende Substanz wird in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst und mit Hilfe einer Kapillare punkt- oder strichförmig aufgetragen. Dies geschieht bei der eindimensionalen DC auf der Startlinie der Folie oder Platte, bei der zweidimensionalen DC (siehe unten) in einer Ecke. Die zu trennende Substanzmenge beträgt ca. 5–20 Mikrogramm. Es ist entscheidend, die Auftragzonen möglichst eng zu halten (wenige Millimeter). Kommerziell erhältlich sind auch DC-Folien mit so genannten Konzentrationszonen unterhalb der Startlinie, beschichtet mit einem Material besonders geringer Adsorption. Die Substanzen in den dort womöglich ungenau platzierten oder großen Probeflecken lösen sich dann unmittelbar bei Durchgang der Lösemittelfront und erreichen mit ihr die Startlinie, in Laufrichtung zusammengestaucht. Für eine besonders gleichmäßige, quantitativ reproduzierbare Auftragung stehen auch Maschinen zur Verfügung, welche die Lösung mit Hilfe von Druckluft oder Stickstoff aufsprühen. Nach dem Auftragen muss die Platte getrocknet werden, da restliches Lösungsmittel das Ergebnis verändern kann.
Neben den Proben werden auf der Startlinie in vielen Fällen auch Lösungen von reinen Vergleichssubstanzen oder Vergleichsmischungen aufgetragen.
Auftrennung 500px|mini|Schematische Darstellung des Ablaufs einer Dünnschichtchromatographie
Nach dem Auftragen wird die Platte senkrecht in eine Chromatographiekammer mit einem geeigneten Fließmittel (mobile Phase) eingestellt. Um eine Beeinflussung der Ergebnisse (zu große ) durch das Verdampfen des Fließmittels zu verhindern, führt man die Trennung in einer mit dem Fließmittel gesättigten Atmosphäre in einem geschlossenen Gefäß durch. Zur besseren Sättigung des Dampfraumes mit Laufmittel kann ein Filterpapier eingelegt werden.
Das Fließmittel saugt sich nun über Kapillarkräfte in die stationäre Phase nach oben. Sobald die Flüssigkeit die Startlinie erreicht hat, lösen sich die Substanzen in ihr. Die Moleküle sind nun den Anziehungskräften der stationären Phase einerseits und den Anziehungskräften der mobilen Phase andererseits ausgesetzt. Je nach Kräfteverhältnis bleibt ein Teilchen eher am Startpunkt oder es wandert mit der mobilen Phase nach oben. Je unpolarer das Fließmittel und je polarer eine Substanz, desto weniger wandert die Substanz. Die Lösungsmittelpolarität ist dabei analog wie in der Säulenchromatographie.