mini|Heatmaps von Genexpressionsdaten zeigen, wie experimentelle Bedingungen die Produktion (Expression) von mRNA für eine Gruppe von Genen beeinflussen. Grün zeigt reduzierte Expression an, während rot für eine verstärkte Expression steht. Clusteranalyse hat eine Gruppe herunterregulierter Gene in der oberen linken Ecke angeordnet.
Die Genexpressionsanalyse ist eine Untersuchung der Umsetzung der genetischen Information (Genexpression als RNA) mit molekularbiologischen und biochemischen Methoden. Sie kann sowohl für einzelne Transkripte als auch für das ganze Transkriptom angewendet werden und ermöglicht qualitative und quantitative Aussagen über die Aktivität der Gene. Während im ersten Fall nur die Sequenzinformation des zu untersuchenden Transkripts bekannt sein muss, wird für die Transkriptom-Analyse die gesamte Sequenzinformation des Transkriptoms gebraucht.
Eigenschaften Mit Hilfe der Genexpressionsanalyse kann die Aktivität und Expression tausender Gene gleichzeitig gemessen werden, was einen Überblick über zelluläre Funktionen ermöglicht. Genexpressionsprofile können beispielsweise verwendet werden, um Zellen zu identifizieren, die in der aktiven Teilungsphase sind, oder aber um die Reaktion von Zellen auf eine spezielle Behandlung aufzuzeigen. Viele derartige Experimente untersuchen das gesamte Genom, d. h. jedes Gen einer spezifischen Zelle.
Die DNA-Microarray-Technik misst die relative Aktivität zuvor identifizierter Zielgene. Sequenz-basierte Methoden wie die serielle Analyse der Genexpression (SAGE, SuperSAGE) werden ebenfalls zur Genexpressionsanalyse verwendet. SuperSAGE ist besonders genau, da diese Methode nicht auf zuvor definierte Gene beschränkt ist, sondern jedes aktive Gen messen kann. Seit der Einführung von Sequenzierungsmethoden der nächsten Generation erfreut sich die Sequenz-basierte „Gesamt-Transkriptom-Shotgun-Sequenzierung“, auch RNA-Seq, zunehmender Beliebtheit, da sie eine digitale Alternative zu Microarrays darstellt. Ein Vergleich von PubMed-Artikeln des Jahres 2015 mit den Begriffen „Microarray“ bzw. „RNA-Seq“ zeigt, dass Microarrays noch etwa dreimal häufiger in den Publikationen Anwendung fanden.
Qualitative Analyse: Wird ein Gen unter den untersuchten Umständen überhaupt exprimiert? In welchen Zellen findet eine Expression statt (beispielsweise in situ Hybridisierung)?
Quantitative Analyse: Wie stark ist der Expressionsunterschied gegenüber einer definierten Referenz? gesunde im Vergleich zu kranken Zellen Wildtyp im Vergleich zu Mutantenzellen unstimulierte im Vergleich zu stimulierten Zellen
Je nach Methode werden die Produkte der verschiedenen Ebenen der Genexpression analysiert: RNA bzw. cDNA Proteine
Die Expressionsanalyse ist der nächste logische Schritt nach der Sequenzierung eines Genoms: die Sequenz gibt Auskunft darüber, was eine Zelle möglicherweise tun könnte, während ein Expressionsprofil zeigt, was die Zelle tatsächlich gerade tut. Gene enthalten die Information zur Erzeugung von Messenger-RNA (mRNA), aber zu jedem beliebigen Zeitpunkt schreibt eine Zelle nur einen Bruchteil ihrer Gene in mRNA um. Wenn ein Gen gerade abgelesen (exprimiert) wird, um mRNA zu produzieren, wird es als „eingeschaltet“ betrachtet, andernfalls als ausgeschaltet. Viele verschiedene Faktoren bestimmen, ob ein Gen ein- oder ausgeschaltet ist. So haben beispielsweise die Tageszeit, die lokale Umgebung, chemische Signale von anderen Zellen sowie die Frage, ob sich die Zelle gerade in aktiver Teilung befindet oder nicht, einen Einfluss auf die Aktivität der Gene. Hautzellen, Leberzellen und Nervenzellen exprimieren zu einem gewissen Grad unterschiedliche Gene, und das erklärt einen Großteil der Unterschiede dieser Zellen. Daher erlaubt eine Expressionsanalyse u. a. Schlussfolgerungen über den Zelltyp sowie den Zustand und die Umgebung einer Zelle. Expressionsanalysen untersuchen häufig die relativen Mengen an mRNA, welche unter zwei oder mehr experimentellen Bedingungen exprimiert werden. Veränderte Pegel einer spezifischen mRNA-Sequenz deuten auf eine Änderung im Bedarf des Proteins an, für welches diese mRNA codiert. Eine derartige Änderung könnte sowohl eine homöostatische Antwort als auch einen pathologischen Zustand anzeigen.
Die Genexpressionsanalyse liefert neue Informationen darüber, wie sich Gene unter verschiedensten Bedingungen verhalten. Im Großen und Ganzen produzieren Microarray-Techniken zuverlässige Expressionsprofile. Basierend auf diesen Daten können neue biologische Hypothesen aufgestellt oder bestehende Hypothesen überprüft werden. Allerdings führen Umfang und Komplexität dieser Experimente häufig zu einer Vielzahl verschiedener Interpretationsmöglichkeiten. In vielen Fällen erfordert die Datenanalyse von Expressionsprofilen wesentlich mehr Zeit und Mühe als das ursprüngliche Experiment zur Generierung der Daten. Viele Wissenschaftler verwenden mehrere statistische Methoden und orientierende Datenanalyse und konsultieren Biostatistiker oder andere Experten im Gebiet der Microarray Technik, bevor sie die Ergebnisse von Genexpressionsanalysen veröffentlichen. Ein guter Versuchsaufbau, eine adäquate Zahl biologischer Replikate sowie Wiederholungsexperimente spielen eine Schlüsselrolle bei der Durchführung erfolgreicher Genexpressionsanalysen.
Beispiel Ein erhöhter Pegel der für Alkoholdehydrogenase codierenden mRNA weist darauf hin, dass die untersuchten Zellen oder Gewebe auf eine erhöhte Alkoholkonzentration reagieren. Wenn Brustkrebszellen eine größere Menge von mRNA eines speziellen Transmembran-Rezeptors exprimieren als normale Zellen, so könnte dies ein Hinweis darauf sein, dass dieser Rezeptor eine Rolle bei Brustkrebs spielt. Ein Medikament, welches diesen Rezeptor hemmt, könnte zur Vorbeugung oder Behandlung von Brustkrebs eingesetzt werden. Bei der Entwicklung eines Medikaments können Genexpressionsanalysen dabei helfen, dessen Toxizität zu bestimmen, indem man nach Veränderungen im Expressionsniveau eines Biomarkers für die Verstoffwechselung von Medikamenten wie etwa Cytochrom P450 schaut. Genexpressionsanalysen könnten somit ein wichtiges diagnostisches Hilfsmittel werden.
Methoden RNA basiert Sowohl DNA-Microarrays als auch qPCR nutzen die bevorzugte Bindung komplementärer Nukleinsäuresequenzen („base pairing“), und beide Methoden kommen, häufig aufeinander folgend, beim Erstellen von Genexpressionsprofilen zum Einsatz. Während DNA-Microarrays eine hohe Durchsatzrate haben, fehlt ihnen die hohe quantitative Genauigkeit der qPCR. Allerdings kann man in der gleichen Zeit, die man benötigt, um die Expression einiger Dutzend Gene mit qPCR zu bestimmen, das gesamte Genom mittels DNA-Microarrays untersuchen. Aus diesem Grund ist es häufig sinnvoll, zunächst eine semiquantitative DNA-Microarray-Analyse zur Identifizierung von Kandidatengenen durchzuführen, welche dann im Anschluss mittels qPCR validiert und genauer quantifiziert werden können. Zusätzliche Experimente, wie etwa Western Blots der Proteine differentiell exprimierter Gene, können dazu beitragen, die Ergebnisse der Genexpressionsanalyse zu untermauern, da mRNA-Konzentrationen nicht unbedingt mit der Menge an exprimiertem Protein korrelieren.
Nach einer RNA-Reinigung können verschiedene Methoden eingesetzt werden: Bei der Northern-Blot-Methode wird RNA zunächst isoliert und elektrophoretisch nach ihrer Größe in einem Gel aufgetrennt. Nach Übertragung auf eine Membran (Blotting) wird die gesuchte RNA-Sequenz durch markierte Sonden (Radioisotope, Fluoreszenz-Farbstoffe) aus komplementärer RNA oder DNA über komplementäre Bindung nachgewiesen. In der Regel werden nur geringe Anzahlen von Sequenzen simultan untersucht. Mit der in-situ-Hybridisierung wird sequenzspezifisch RNA eines definierten Gens/Gen-Sets im Gewebe detektiert und das lokale Genexpressionsmuster bestimmt. Beim RNase Protection Assay werden RNA mit spezifisch hybridisierenden radioaktiv markierten antisense-RNA-Hybridisierungssonden vor einem Abbau durch Einzelstrang-abbauende RNasen geschützt. Die geschützten RNA-Moleküle werden mittels Gelelektrophorese aufgetrennt, autoradiographisch nachgewiesen und quantifiziert. Mit dem nukleären Run-on Assay (engl. nuclear run-on assay) lassen sich RNA-Abschnitte mit transkriptionell aktiver RNA-Polymerase II im Genom identifizieren. Sie beruht darauf, dass gerade entstehende RNA markiert und nachgewiesen wird.S. T. Smale: Nuclear run-on assay. In: Cold Spring Harbor protocols. Band 2009, Nummer 11, November 2009, S. pdb.prot5329, doi:10.1101/pdb.prot5329, PMID 20150068. Dies geschieht durch Hybridisierung der RNA mit einzelnen Zielsequenzen mittels Dot Blot, oder als Nuclear-run-on-Sequenzierung, basierend auf der Sequenzierung der nächsten Generation, auch auf der Ebene des Transkriptoms.L. J. Core, J. J. Waterfall, J. T. Lis: Nascent RNA sequencing reveals widespread pausing and divergent initiation at human promoters. In: Science. Band 322, Nummer 5909, Dezember 2008, S. 1845–1848, doi:10.1126/science.1162228, PMID 19056941, . In DNA-Microarrays oder -Makroarrays kann die Menge an mRNA einer Vielzahl von Genen aus Zellen einer Kultur/eines Gewebes simultan bestimmt werden. Dazu wird die mRNA isoliert und in cDNA umgeschrieben. Die Detektion erfolgt bei dieser Methode über komplementäre Hybridisierung der markierten cDNA (Radioisotope, Fluoreszenzfarbstoffe) mit den Sonden des DNA-Arrays. Mit der Seriellen Analyse der Genexpression (SAGE) und insbesondere SuperSAGE kann die Expression theoretisch aller Gene einer Zelle sehr genau bestimmt werden, indem von jedem Transkript ein kurzes Sequenzstück (das sog. „Tag“ = engl. Etikett) erzeugt wird und möglichst viele dieser Tags sequenziert werden. Vorteil gegenüber Microarrays ist die sehr viel genauere Quantifizierung der Transkripte sowie die Möglichkeit, (v. a. mit SuperSAGE) neue Transkripte (z. B. nichtcodierende Ribonukleinsäuren, wie microRNAs oder antisense-RNAs) zu identifizieren und Organismen mit bisher nicht bekannten Genomen zu untersuchen. Beim Differential display (engl. für Differentielle Darstellung, auch DDRT-PCR oder DD-PCR genannt) wird die Änderung der Genexpression auf der Ebene der mRNA zwischen zwei eukaryontischen zellulären Proben verglichen. Da hier zufällig gewählte Primer eingesetzt werden, setzt sie keine Kenntnis über die vorhandenen mRNAs voraus.P. Liang, A. B. Pardee: Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of the polymerase chain reaction. In: Science. Band 257, Nummer 5072, August 1992, S. 967–971, PMID 1354393.P. Liang: A decade of differential display. In: BioTechniques. Band 33, Nummer 2, August 2002, S. 338–44, 346, PMID 12188186 (Review). Die Real-Time-quantitative-PCR ist eine Variante der Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Durch dem Reaktionsgemisch zugesetzte Farbstoffe oder spezielle Sonden wird die Konzentration des Produktes während der PCR verfolgt. Die zeitliche Änderung der Konzentration ermöglicht Rückschlüsse auf die Ausgangskonzentration der betreffenden Nukleinsäure. Alternativ wird die Digital PCR zur Quantifizierung durchgeführt. Mit der „Gesamt-Transkriptom-Shotgun-Sequenzierung“, auch RNA-Seq genannt, die hohe Ansprüche an die bioinformatische Auswertung stellt, versucht man das Transkriptom einer Zelle oder eines Gewebes, also die mengenmäßige Verteilung möglichst aller Transkripte zu bestimmen. Ribosomal Profiling, der Nachweis aller RNAs einer Zelle, die zu einem bestimmten Zeitpunkt an Ribosomen gebunden und daher vermutlich translatiert werden, wurde durch das RNA-Seq möglich. Durch die Sequenzierung der Ribosomen-Footprints (Ribo-Seq) ist die Nukleotid-genaue Kartierung möglich.M. A. Mumtaz, J. P. Couso: Ribosomal profiling adds new coding sequences to the proteome. In: Biochemical Society transactions. Band 43, Nummer 6, Dezember 2015, S. 1271–1276, doi:10.1042/BST20150170, PMID 26614672 (Review).
Protein basiert