mini|hochkant=1.5|Zweiphotonen-Fluoreszenzaufnahme an einem Schnitt durch einen Mausdarm. Zellkerne in Grün, Schleim der Becherzellen in Blau, Aktin (Phalloidin-Färbung) in Rot. Anregung erfolgte bei 780 nm durch einen Titan:Saphir-Laser. mini|hochkant=1.5|Zweiphotonenaufnahme eines gefärbten Rhizom-Querschnitts des Maiglöckchens. Die Anregung erfolgte mit 840 nm, drei Farbkanäle wurden aufgezeichnet und übereinander gelegt. Ein Multiphotonenmikroskop (, MPLSM, auch , MPM) ist ein spezielles Lichtmikroskop aus der Gruppe der Laser-Scanning-Mikroskope.
Bilder werden erzeugt, indem eines von zwei unterschiedlichen physikalischen Phänomenen ausgenutzt wird: Multiphotonen-Fluoreszenz (meist Zwei-Photonen-Fluoreszenz) oder (Verdopplung (, SHG) oder Verdreifachung (, THG) der Schwingungsfrequenz des eingestrahlten Lichtes).
Mit Hilfe eines starken, fokussierten Laserstrahls werden dabei nichtlineare optische Effekte erzeugt, die auf dem Zusammenspiel mehrerer gleichzeitig in einem Molekül eintreffender Photonen (Lichtteilchen) beruhen. Die Stärke des erzeugten Signals steigt daher nicht linear mit der Zahl der eingestrahlten Photonen, sondern mit dem Quadrat (bei Zwei-Photonen-Effekten) oder der dritten Potenz (bei Drei-Photonen-Effekten).
Die Arbeitsweise eines Multiphotonenmikroskops ähnelt der eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops. Während jedoch die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie eine Eindringtiefe je nach Präparat von 50–80 µm hat, können mit der Multi-Photonen-Mikroskopie tiefere Bereiche, z. B. von 200 µm, in sehr günstigen Fällen sogar bis zu 1000 µm (=1 mm) erreicht werden. Dadurch sind Aufnahmen von lebenden Geweben möglich, die anderweitig für die Bildgebung unerreichbar sind.
Die erreichbare Auflösung von Multiphotonenmikroskopen ist im Artikel Auflösung (Mikroskopie) im Abschnitt Multi-Photonen-Anregung beschrieben.
Multi-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie mini|Spektrum des sichtbaren Lichts. Kurzwelliges Licht (links) ist energiereicher als langwelliges (rechts). Die am weitesten verbreitete Multiphotonentechnik ist die Zwei-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie, manchmal auch nur Zweiphotonenmikroskopie genannt. Bei der herkömmlichen Fluoreszenzmikroskopie wird in einem fluoreszierenden Molekül ein Elektron durch die Absorption jeweils eines Photons angeregt, also in einen höheren Energiezustand versetzt. Bei der Zwei-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie wird die Anregung des Elektrons durch die gleichzeitige Absorption zweier Photonen hervorgerufen (Zwei-Photonen-Absorption). Auch eine Anregung mit drei oder mehr gleichzeitig eintreffenden Photonen ist möglich.
Prinzip mini|links|hochkant=1.5|Schematische Darstellung der Energieniveaus (Jabłoński-Schema) bei Fluoreszenzanregung am Beispiel eines mit 460 nm leuchtenden Fluoreszenz-Farbstoffes. Ein (lila), zwei (hellrot) oder drei Photonen (dunkelrot) werden absorbiert um ein Fluoreszenz-Photon (türkis) auszusenden.
mini|Theoretische Verteilung des Fluoreszenzlichts einer punktförmigen Struktur (Punktspreizfunktion) bei normaler (Weitfeld-)Fluoreszenzmikroskopie, Zwei-Photonen-Mikroskopie und konfokaler Mikroskopie, oben in der Fokusebene, unten entlang der optischen Achse.
Fluoreszenz entsteht, wenn Farbstoffe ankommende Photonen absorbieren und in der Folge ein anderes Photon wieder abgeben. Durch das ankommende, „anregende“ Photon wird ein Elektron auf ein höheres Energieniveau gehoben, die Energie also derart zwischengespeichert. Bei normaler Fluoreszenzmikroskopie geschieht diese Anregung durch genau ein Photon. Das Elektron bleibt für einige Nanosekunden auf dem höheren Energieniveau, bevor es wieder zurückfällt und dabei ein neues, längerwelliges, energieärmeres Photon aussendet. Wenn etwa mit blauem Licht angeregt wird, entsteht meist grüne Fluoreszenz, beispielsweise bei Fluorescein.
Dieses einzelne Anregungsphoton kann durch zwei oder mehr Photonen ersetzt werden, wenn diese in der Summe die gleiche Energie haben. So kann dunkelrotes oder infrarotes Licht eingesetzt werden, um grüne Fluoreszenz zu erzeugen. Außerdem müssen beide Photonen gleichzeitig (innerhalb einer Attosekunde = 10−18 s) eintreffen, da kein stabiles Zwischenenergieniveau existiert.
Bei der normalen Fluoreszenzmikroskopie hat das anregende Photon eine kürzere Wellenlänge, d. h. eine höhere Frequenz und somit mehr Energie als das abgestrahlte Photon. Die Wellenlängen-Differenz der beiden Photonen wird als Stokes-Shift bezeichnet. Im Gegensatz dazu wird bei der Multi-Photonen-Anregung mit Photonen angeregt, die eine deutlich größere Wellenlänge, niedrigere Frequenz und somit pro Photon weniger Energie haben, als die ausgesandten Photonen. Dies ist nur möglich, weil hier zwei oder mehr anregende Photonen zur Erzeugung nur eines ausgesandten Photons führen. Bei der Zwei-Photonen-Anregung beträgt die Anregungswellenlänge in etwa das Doppelte der normalerweise verwendeten Anregungswellenlänge, bei Drei-Photonen-Anregung ein Dreifaches.W. Denk, D. W. Piston, W. W. Webb: Multi-Photon Molecular Excitation in Laser-Scanning Microscopy. In: James B. Pawley (Hrsg.): Handbook of biological Confocal Microscopy. 3. Auflage. Springer, New York NY 2006, ISBN 0-387-25921-X.
Technische Umsetzung mini|hochkant=2|Schema eines Zweiphotonenmikroskops mit Detektoren für grüne und rote Fluoreszenz Um ein gleichzeitiges Eintreffen zweier oder mehr Photonen bei den anregbaren Elektronen im Fokuspunkt zu erreichen, sind sehr hohe Photonendichten erforderlich. Diese werden nur erzielt, wenn ein gepulster Laser mit Modenkopplung eingesetzt wird. Das Besondere an diesem Lasertyp ist, dass sehr kurze (z. B. 0,14 ps = 0,14·10−12 s), intensive Laserpulse ausgesandt werden, die z. B. 80 Millionen Mal pro Sekunde wiederholt werden. Die Pausen zwischen zwei Pulsen sind im gegebenen Beispiel also 12,5 ns (= 12.500 ps) lang, so dass die gesamte im Laser erzeugte Energie in einem Bruchteil der Zeit abgegeben werden kann.Datenblatt des Chameleon Ultra II (PDF; 363 kB) der Firma Coherent.
Die für die Anregung in der Regel eingesetzten Titan:Saphir-Laser sind kostspielig (ca. 150.000 Euro) und stellen daher eine große Hürde für einen verbreiteten Einsatz dar. Ti:Sa-Laser können auf Wellenlängen von etwa 700 nm bis etwa 1050 nm eingestellt werden. Größere Wellenlängen können durch den Einsatz eines „optisch parametrischen Oszillators“ (OPO) erzeugt werden. Dieser wird mit dem Ti:Sa-Laser „gepumpt“ und kann dann Wellenlängen bis über 1300 nm erzeugen. Damit können auch rote und dunkelrote Fluoreszenzfarbstoffe im Zwei-Photonen-Modus angeregt werden.
Wie bei einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop wird der Laserstrahl durch das Objektiv des Mikroskops auf einen Punkt des Präparats fokussiert. Durch im Strahlengang befindliche bewegliche Spiegel (Scanspiegel; engl. = abrastern) wird der Laserstrahl in seiner Lage so verändert, dass der Fokuspunkt sich durch das Präparat bewegt, dieses also abrastert. Die dadurch entstehende Fluoreszenz wird vom Objektiv aufgefangen, über dichroitische Strahlteiler spektral aufgetrennt und zum Detektor geleitet (vorwiegend Photomultiplier, aber auch Avalanche-PhotodiodenPeter T. C. So, Chen Y. Dong, Barry R. Masters, Keith M. Berland: Two-photon excitation fluorescence microscopy. (PDF; 4,7 MB). In: Annu. Rev. Biomed. Eng. Nr. 2, 2000, S. 399–429.). Die Detektoren messen die Helligkeit jedes Bildpunktes also nacheinander. Zu keinem Zeitpunkt entsteht im Mikroskop ein vollständiges Bild des Präparats, dies wird erst im Steuerungscomputer zusammengesetzt.
Auf Grund der Komplexität werden Komplettgeräte derzeit nur von wenigen Herstellern angeboten. Da die Scanning- und Detektortechnik eines Multiphotonenmikroskops der eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops sehr ähnlich ist, gibt es einige Firmen, die entsprechende Erweiterungen anbieten, sowie Arbeitsgruppen, die solche Mikroskopie in Eigenregie mit einem geeigneten Anregungslaser und den entsprechenden Filtern zum Multiphotonenmikroskop aufrüsten.
Vorteile
Wie oben dargestellt, erfordert die Erzeugung des Zwei-Photonen-Effekts eine sehr hohe Photonendichte, die nur ein gepulster Laser erzielen kann. Aber auch in diesem Fall kommt es nur im Fokuspunkt zu einer genügend hohen Photonendichte, um eine Fluoreszenzanregung zu erzeugen, nicht aber darüber und darunter (siehe Abbildung): Außerhalb der Fokusebene verteilt sich die gleiche Menge Anregungsphotonen auf einen stark zunehmenden Durchmesser des Strahlkegels. Zwei-Photonen-Anregung hängt aber vom Quadrat der Lichtintensität ab, so dass die Lichtintensitäten außerhalb der Fokusebene, im Gegensatz zu anderen Fluoreszenzmikroskopen, für die Erzeugung von Fluoreszenz nicht mehr ausreicht.
Daraus ergeben sich praktische Vorteile: Ein Ausbleichen von Fluoreszenzfarbstoffen und die Erzeugung von Phototoxizität ist auf eine extrem kleine Umgebung des Fokuspunktes beschränkt. Ebenen darüber und darunter sind nicht betroffen. Die gesamte vom Objektiv aufgefangene Fluoreszenz kann für das zu erstellende Bild verwendet werden. Im Gegensatz zum konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop ist also keine Lochblende () nötig, um Licht aus anderen Ebenen auszufiltern. Daher ist es, wiederum im Vergleich zum konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop, auch nicht nötig, die Fluoreszenz über die Scanspiegel aufzufangen. Stattdessen kann eine „“ durchgeführt werden. Die Detektion kann dadurch räumlich dichter am Präparat erfolgen, was wiederum das Auffangen eines Teils der im Präparat gestreuten Fluoreszenz erlaubt. Ein davon unabhängiger Vorteil ist die höhere Eindringtiefe durch die geringere Streuung von längerwelligem Licht. Der Streuquerschnitt σ hängt sehr stark von der Frequenz ν ab und steigt proportional zu ν4. Kurzwelliges violettes Licht (400 nm) hat eine doppelt so hohe Frequenz wie langwelliges rotes Licht (800 nm) und wird daher 16-mal stärker gestreut (siehe Das Blau beziehungsweise das Rot des Himmels). Wellenlängenabhängige Streuung geschieht auch in biologischen Geweben: Wenn mit einer starken Taschenlampe durch eine Hand geleuchtet wird, dringt fast nur der rote Lichtanteil durch. Da bei der Zwei-Photonen-Mikroskopie infrarotes oder dunkelrotes Licht für die Fluoreszenzanregung eingesetzt wird, können entsprechend tiefere Regionen erreicht werden.
Higher Harmonic Generation Neben Fluoreszenz spielen in der Multiphotonenmikroskopie Second und Third Harmonic Generation (SHG bzw. THG; wörtlich: Erzeugung der zweiten (bzw. dritten) Harmonischen; im Deutschen auch: Frequenzverdopplung bzw. Frequenzverdreifachung) eine Rolle. Sie werden als (HHG) zusammengefasst.
Diese Erzeugung von Licht mit niedrigerer Wellenlänge ist physikalisch nicht verwandt mit Multiphotonen-Fluoreszenzanregung. HHG tritt aber unter gleichartigen Beleuchtungsbedingungen auf wie Multiphotonenfluoreszenz, nämlich (nur) bei sehr starkem Anregungslicht. Auch HHG-Signale entstehen daher nur im Fokuspunkt eines gepulsten Lasers, aber nicht darüber oder darunter. Die oben dargestellten Abschnitte ‚Technische Umsetzung‘ und ‚Vorteile‘ gelten entsprechend. Die erforderliche technische Ausstattung ist weitgehend gleich, so dass beispielsweise ein Gerät, das für Zwei-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie gebaut wurde, meistens auch Second Harmonic Generation ermöglicht.
Grundlagen
Licht ist eine elektromagnetische Strahlung, entsprechend hat es ein elektrisches Feld. Dieses Feld tritt in Wechselwirkungen mit der durchstrahlten Materie. Wenn im Multiphotonenmikroskop der gepulste Laser auf ein Präparat fokussiert wird, führen diese Wechselwirkungen zur Entstehung von „Harmonischen“. Die Wellenlänge der „Second Harmonic“ ist exakt die Hälfte des eingestrahlten Lichtes, die der „Third Harmonic“ bei THG exakt ein Drittel.