Die Zytogenetik (auch Cytogenetik, Zellgenetik) ist das Teilgebiet der Genetik, das die Chromosomen vorwiegend mit dem Lichtmikroskop analysiert. Untersucht werden Anzahl, Gestalt, Struktur und Funktion der Chromosomen, denn die DNA eines Chromosomensatzes im Zellkern enthält den größten Teil der Erbinformation (des Genoms) eines Lebewesens. Anomalien der Chromosomen versucht man mit deren phänotypischer Auswirkung zu verbinden. mini|Normaler Karyotyp eines Mannes: technisch gebänderte Metaphase-Chromosomen (46,XY)
Chromosomen erfassen Sowohl während der Meiose in Prophase 1 (Zygotän, Pachytän, Diplotän, Diakinese), Metaphase 1 und Metaphase 2 als auch während der mitotischen (Pro-)Metaphase lassen sich Chromosomen individuell erkennen und der Karyotyp erstellen. Nach Endoreplikation sind vergrößerte Chromosomen in Endometaphasen und während des ganzen Zellzyklus als Polytänchromosomen sichtbar. Der DNA-Gehalt eines Chromosomensatzes erschließt die Genomgröße eines Organismus, zeigt das Ausmaß von eventueller Endoreplikation und lässt auch selektive Endoreplikation ermessen.
Die Länge eines stabil vererbbaren Chromosomen-Armes ist durch die Ausdehnung der Spindelachse in der Anaphase begrenzt.Ingo Schubert, J. L. Oud: There is an upper limit of chromosome size for normal development of an organism. In: Cell. Band 88, 1997, S. 515–520. Deswegen sind die Elemente eines Karyotyps als Kompartimente eines großen Genoms zu verstehen. Frühe Versuche, ihre Anzahl beim Menschen zu bestimmen, ergaben 46 bis 48 Chromosomen; lediglich über das XX/XY-System der Geschlechtsbestimmung war man sich einig.Hans von Winiwarter: Études sur la spermatogenese humaine. In: Archives de Biologie (Liege) Band 27, Nr. 93, 1912, S. 147–149.Theophilus S. Painter: Studies in mammalian spermatogenesis, II. The spermatogenesis of man. In: Journal of Experimental Zoology Band 37, 1923, S. 291–336, 1923. Reproduzierbare Analysen in den 1950er-Jahren verschafften der normalen menschlichen Karyotyp-Formel 2n = 46 allgemeine Anerkennung.T. C. Hsu: Mammalian chromosomes in vitro, I. The karyotype in man. (PDF) In: Journal of Heredity Band 43, 1952, S. 167–172.Joe Hin Tjio, Albert Levan: The chromosome number of man. In: Hereditas Band 42, 1956, S. 1–6.
Forschungsgeschichte
Theodor Boveri und Walter Sutton entwickelten unabhängig voneinander die Chromosomentheorie der Vererbung. Sie besagt kurzgefasst: Individuelle Chromosomen enthalten unterschiedliche Erbfaktoren (Gene).Theodor Boveri: Über mehrpolige Mitosen als Mittel zur Analyse des Zellkerns. In: Verh Phys-Med Ges Würzburg Band NF 35, 1902, S. 67–90, S. 81. Die polare Auftrennung der homologen Chromosomen eines Bivalentes erfolgt in der Meiose zufällig und unabhängig von der anderer Bivalente. Entsprechend zufällig werden die Gene der Bivalente verteilt. Dies entspricht den Regeln von Gregor Mendel. Innerhalb der einzelnen Chromosomen sind die Gene jedoch „gekoppelt“.Walter Sutton Stanborough: The chromosomes in heredity. In: Biol Bull Marine Biol Labor Woods Hole (Mass.) Band 4, 1902 (oder 1903), S. 231–248.
Methoden Der Erfolg der Zytogenetik hing von der Einsicht ab, dass man Gewebe nicht mit dem Mikrotom zerschneiden durfte, sondern deren Zellen in hypotonischer Lösung mit feinen Nadeln möglichst voneinander trennen sollte. Sanftes Quetschen drückt die Chromosomen in eine Ebene. Farbstoffe wie Karmin, Orcein oder das Giemsa-Gemisch machen Chromosomen zu Farbkörpern, um sie vom Zytoplasma abzuheben. Besonders deutlich gelingt dies mit der Feulgenreaktion (Feulgen-Prozedur), weil sie spezifisch die chromosomale DNA (Kern-DNA) anfärbt.
In der pathologischen Routine werden Schnittpräparate menschlicher Gewebe begutachtet. Um für zytogenetische Probleme eine Fraktion unverletzter mitotischer Zellkerne zu erhalten, ist das Mikrotom auf 15 μm Schnittdicke einzustellen.Rüdiger G. Steinbeck, Gert U. Auer, Anders D. Zetterberg: Reliability and significance of DNA measurements in interphase nuclei and division figures in histological sections. In: European Journal of Cancer Band 35, Nr. 5, 1999, S. 87–795.
Induzierte Bänderung Die klassischen Methoden erlaubten jedoch nicht, die menschlichen (Metaphase-)Chromosomen zweifelsfrei zu unterscheiden. Dies gelang erst durch besondere Bänderungstechniken an Nicht-Interphasekernen. So ruft der fluoreszierender Farbstoff (Fluorochrom) Quinacrin ein Bandenmuster hervor, das die einzelnen Chromosomenpaare identifiziert.Torbjörn Caspersson, Lore Zech, C. Johansson: Differential binding of alkylating fluorochromses in human chromosomes. In: Experimental Cell Research Band 60, 1970, S. 315–319. Charakteristische Bandenmuster entstehen auch, wenn die DNA in den Chromosomen etwas denaturiert wird.Wolfgang Schnedl: Analysis of the human karyotype using a reassociation technique. In: Chromosoma Band 34, 19971, S. 448–454.J. J. Yunis: High resolution of human chromosomes. In: Science. Band 191, Nummer 4233, März 1976, S. 1268–1270, PMID 1257746. doi:10.1126/science.1257746. Ein genormtes Kürzelsystem bezeichnet jeden Abschnitt der technisch gebänderten Chromosomen.L. G. Shaffer, J. McGowan-Jordan, M. Schmid (Hrsg.): ISCN 2013. An international system for human cytogenetic nomenclature (2013): Recommendations of the international standing committee on human cytogenetic nomenclature, published in collaboration with "Cytogenetic and Genome Research" plus fold-out: "The Normal Human Karyotype G- and R-bands". Karger, Basel 2012. ISBN 978-3-318-02253-7. Das p steht für (franz. klein) und bezeichnet den kurzen Arm eines Chromosoms. Für den langen Arm wählte man den nachfolgenden Buchstaben q. So können nicht nur anomale Chromosomenzahlen (wie Trisomie 21) festgestellt, sondern auch strukturelle Chromosomenänderungen (Deletionen, Duplikationen, Translokationen) erfasst werden.
Genaktivität und Replikation Um die Interphase im Zellzyklus zu studieren, bot man lebenden Zellen radioaktiv markierte Moleküle an. Einbau von 3H-Uridin, spezifisch für RNA, wies die Genexpression aktiver Chromosomenorte nach.Claus Pelling: Chromosomal synthesis of ribonucleic acid as shown by incorporation of Uridine labelled with tritium. (PDF) In: Nature Band 184, 4686, 1959, S. 655–656, 1959. Einbau von 3H-Thymidin, spezifisch für DNA, zeigte die chromosomale DNA-Synthese in der S-Phase.James Herbert Taylor, Philip S. Woods, Walter L. Hughes: The organization and duplication ofNr. chromosomes as revealed by autoradiographic studies using tritium-labeled thymidine. In: PNAS Band 43, 1957, S. 122–128. Als Betastrahlung hinterließen Elektronen jeweils ihre Spuren als Autoradiografie in einem den Zellen aufgelegten Film. In späteren Replikationsanalysen ersetzte Bromdesoxyuridin das radioaktiv markierte Thymidin. Fortgeschrittene Gentechnik machte auch bei Fragen zur Genaktivität radioaktive Substanzen überflüssig. Dabei verlagert sich der Nachweis von der Transkriptionsebene (RNA-Synthese) auf die vollendete Translation: Ort und Zeit der Aktivierung eines genspezifischen Promotors werden durch das vom Reportergen hervorgerufene Protein angezeigt. Als Voraussetzung muss die DNA-Sequenz des Reportergens hinter die Promotorsequenz des zu untersuchenden Gens gehängt werden. Mit diesem DNA-Konstrukt wird ein Organismus transformiert. Beliebt ist das Reportergen, welches das Grün fluoreszierende Protein (GFP) kodiert.S. R. Kain, M. Adams, A. Kondepudi, T. T. Yang, W. W. Ward, P. Kitts: Green fluorescent protein as a reporter of gene expression and protein localization. In: BioTechniques Band 19, Nr. 4, 1995, S. 650–655. Mit diesem System kann man Genexpression in Zellen, Geweben und Organen verfolgen.
Restriktionsenzyme Die Isolierung zahlreicher DNA-Restriktasen bedeutete für die Zytogenetik und für die Genetik allgemein einen revolutionären, nachhaltigen Durchbruch. Diese meist aus Bakterien gewonnenen Enzyme sind molekulare Scheren: Sie zerschneiden DNA an kurzen, definierten Basensequenzen.Werner Arber, S. Linn: DNA modification and restriction. In: Annual Review of Biochemistry Band 38, 1969, S. 467–500. (Print), (Electronic).Hamilton O. Smith, K. W. Wilcox: A restriction enzyme from Hemophilus influenzae, I. Purification and general properties. In: Journal of Molecular Biology Band 51, Nr. 2, 1970, S. 379–391. (Print), (Electronic).K. Danna, Daniel Nathans: Specific cleavage of simian virus 40 DNA by restriction endonuclease of Hemophilus influenzae. In: PNAS Band 68, Nr. 12, 1971, S. 2913–2917. Werner Arber: Restriction endonucleases. In: Angewandte Chemie (Internationale Ausgabe in Englisch) Band 17, Nr. 2, 1978, S. 73–79. (Print), (Electronic). Die Restriktasen und die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) sind die beiden Pfeiler der modernen molekularen Genetik und Gentechnik.Richard J. Roberts: How restriction enzymes became the workhorses of molecular biology. In: PNAS Band 102, Nr. 17, 2005, S. 5905–5908. Sie ermöglichen, ganze Genome zu sequenzieren oder verschiedene Arten der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) durchzuführen. Für letztere werden DNA- oder RNA-Proben mit Fluorochromen markiert und auf komplementäre DNA-Sequenzen der angepeilten Chromosomen hybridisiert. Zur Diagnose ist ein Fluoreszenzmikroskop erforderlich. mini|Interphasen-Zytogenetik bzw. Molekularzytogenetik: durch Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung sichtbar gemachte Chromosomentranslokation t(9;22)
Mit FISH bemalte Chromosomen Für das „Bemalen“ werden gleichzeitig mehrere Sonden (), mit unterschiedlichen Fluorochromen markiert, auf Metaphasen hybridisiert. So erhält jedes Chromosomenpaar im Karyotyp durch das Chromosome painting einen eigenen Farbton.Thomas Ried, Evelin Schröck, Yi Ning, Johannes Wienberg: Chromosome painting: a useful art. In: Human Molecular Genetics Band 7, Nr. 10, 1998, S. 1619–1626. Zu diesem Zweck gibt es zwei Verfahren. Mehrfarben (multiplex) Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (M-FISH). Von einer mit verschiedenen Fluorochromen dekorierten Metaphase werden entsprechend viele Digitalbilder aufgenommen. Ein Computerprogramm analysiert die Originalaufnahmen und vereinigt sie in einem einzigen Bild, das die Chromosomenpaare in gut unterscheidbaren Falschfarben darstellt.Michael R. Speicher, David C. Ward: The coloring of cytogenetics. In: Nature Medicine Band 2, Nr. 9, 1996, S. 1046–1048, 1996. doi:10.1038/nm0996-1046. Die Methode ist auch bestens geeignet, Chromosomenmutationen in Interphase-Zellkernen darzustellen (Bild: Interphasen-Zytogenetik). Spectral karyotyping (SKY). Diese Art des Chromosome painting erfordert leistungsstarke Rechner. Denn von jedem Pixel des Digitalbildes werden zwei Teilstrahlen hergestellt, welche mittels Interferometer mit Gangunterschied zur Interferenz gebracht werden. Eine Fourier-Transformation liefert aus dem Interferogramm genaue Daten über das ursprüngliche Fluoreszentspektrum. Von diesem erzeugt ein nachgeschaltetes Computerprogramm wiederum gut unterscheidbare Falschfarben für die einzelnen Chromosomenpaare im Karyotyp.Evelin Schröck, S. du Manoir, T. Veldman, B. Schoell, J. Wienberg, M. A. Ferguson-Smith, Y. Ning, D. H. Ledbetter, I. Bar-Am, D. Soenksen, Y. Garini, Thomas Ried: Multicolor spectral karyotyping of human chromosomes. In: Science Band 273, Nr. 5274, 1996, S. 494–497. doi:10.1126/science.273.5274.494. Als Fourier-Spektroskopie bietet SKY gegenüber M-FISH den Vorteil größerer Abstände zwischen chromosomalen Signalen und Rauschen.H. Parsche, K. Luchner: Moderne Methoden der Spektralanalyse. In: Physik in unserer Zeit Band 6, 1975, S. 151–161. Online .
Duale Hybridisierung