Die quantitative Echtzeit-PCR oder engl. real-time quantitative PCR (kurz qPCR oder Real Time Detection PCR, kurz RTD-PCR) ist eine Vervielfältigungsmethode für Nukleinsäuren, die auf dem Prinzip der herkömmlichen Polymerase-Kettenreaktion (PCR) beruht und zusätzlich die Quantifizierung der gewonnenen DNA ermöglicht. Die qPCR wird gelegentlich auch uneindeutig zur reversen Transkription mit nachfolgender q-PCR (im selben Ansatz) als qRT-PCR oder RT-qPCR bezeichnet.
Die Quantifizierung wird mit Hilfe von Fluoreszenz-Messungen durchgeführt, die während eines PCR-Zyklus in Echtzeit (engl. real time) erfasst werden. Die Fluoreszenz nimmt proportional mit der Menge der PCR-Produkte zu. Am Ende eines Laufs (der aus mehreren Zyklen besteht) wird anhand von erhaltenen Fluoreszenzsignalen die Quantifizierung in der exponentiellen Phase der PCR vorgenommen. Nur in der exponentiellen Phase der PCR (die wenige Zyklen in einem Lauf dauert) ist die korrekte Quantifizierung möglich, da während dieser Phase die optimalen Reaktionsbedingungen herrschen. Diese Methode unterscheidet sich somit von anderen quantitativen PCR-Methoden (qPCR), die erst nach Ablauf der PCR eine quantitative Auswertung (z. B. Kompetitive PCR), meist unter Einbeziehung einer gelelektrophoretischen Auftrennung der PCR-Fragmente, vornehmen.
Die quantitative Echtzeit-PCR kann auch für andere Zwecke verwendet werden, z. B. zur Unterscheidung zwischen homozygoten und heterozygoten Merkmalsausprägungen.
Für die qPCR wird manchmal die Abkürzung RT-PCR oder qRT-PCR verwendet. Dies führt aber zu Verwechslungen, da diese Abkürzung bereits für die Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion verwendet wird.
Methoden Farbstoffe Die einfachste Möglichkeit der Quantifizierung der PCR-Produkte ist die Nutzung von DNA-Farbstoffen (z. B. Ethidiumbromid oder SYBR Green I). Diese Fluoreszenzfarbstoffe lagern sich in die DNA ein (interkalieren) bzw. binden an die kleine Furche der doppelsträngigen DNA ( minor groove binder), wodurch die Fluoreszenz dieser Farbstoffe ansteigt. Die Zunahme der gefärbten Target-DNA korreliert daher mit der Zunahme der Fluoreszenz von Zyklus zu Zyklus. Die Messung findet am Ende der Elongation in jedem Zyklus statt.
Ein Nachteil dieses Verfahrens ist die geringe Spezifität, da zwischen verschiedenen PCR-Produkten nicht unterschieden werden kann. Außerdem können keine Multiplex-Messungen durchgeführt werden. Den ersten Nachteil kann man ausgleichen, indem man nach abgelaufener PCR eine Schmelzkurvenanalyse durchführt, anhand derer die Fragmentlänge(n) und dadurch die Spezifität bestimmt werden kann.
Bei einer Schmelzkurvenanalyse wird die DNA aufgeschmolzen, indem die Temperatur langsam kontinuierlich erhöht wird (50 °C → 95 °C). Bei einer für das Fragment spezifischen Schmelztemperatur denaturiert der Doppelstrang zu zwei einzelsträngigen Molekülen. Dabei wird ein Fluoreszenzfarbstoff (z. B. SYBR Green I) freigesetzt und eine Änderung der Fluoreszenz gemessen. Die Schmelzkurve und die Schmelztemperatur eines dsDNA-Fragmentes sind im Wesentlichen abhängig von der Länge und Basenzusammensetzung des DNA-Fragmentes. Die Schmelzkurvenanalyse kann eingesetzt werden, um Auskunft über die Spezifität der PCR-Reaktion zu erhalten. Da die doppelsträngige DNA von spezifischen PCR-Produkten einen höheren Schmelzpunkt hat als unspezifisch entstehende Primerdimere, ist eine Unterscheidung möglich. Eine weitere Verwendung der Schmelzkurvenanalyse ist der Vergleich und die Unterscheidung unterschiedlicher PCR-Produkte (unterschiedliche DNA-Sequenz, eventuell unterschiedliche Fragmentgröße) bezüglich ihres Schmelzverhalten. Die Darstellung der Schmelzkurve erfolgt in vielen Fällen durch das Auftragen des Absolutwertes der ersten Ableitung des Fluoreszenzsignals (y-Achse) gegen die Temperatur (x-Achse). Die dadurch dargestellten Schmelzkurven-Peaks sind charakteristisch für ein jeweiliges PCR-Produkt und die Schmelzkurvenanalyse dient somit einer qualitativen Untersuchung des PCR-Produktes. Die Höhe (oder ein anderes Merkmal) der Schmelzkurven-Peaks ist kein Parameter zur Quantifizierung der DNA-Menge.
FRET-Sonden Eine andere Möglichkeit besteht darin, den Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) auszunutzen. Ein Donor-Fluorochrom (Reporter – im Zusammenhang mit TaqMan-Sonden), das durch eine Lichtquelle angeregt wird, gibt einen Teil seiner Energie an ein in ausreichender Nähe befindliches Akzeptor-Fluorochrom (bzw. einen dark Quencher – im Zusammenhang mit TaqMan Sonden) ab. Nimmt der Abstand zwischen Akzeptor und Donor zu, so nimmt FRET und somit das Fluoreszenzsignal des Akzeptors ab, während das des Donors zunimmt. Diese Methode ist sehr aufwendig und teuer, bietet aber die Vorteile der hohen Spezifität des Assays.
LightCycler-Sonden (auch Hybridisierungs-Sonden) Die einfachste Möglichkeit der Nutzung des FRET zur Quantifizierung von Nukleinsäuren besteht in der Verwendung von LightCycler-Sonden. Zwei verschiedene, jeweils mit einem FRET-Donor bzw. FRET-Akzeptor (hier Reporter) markierte Oligonukleotide, die nebeneinander an die Ziel-Sequenz binden und damit die Fluorochrome in eine für den FRET ausreichende Nähe bringen, können als Sonden für die Quantifizierung der PCR-Produkte eingesetzt werden. Die Messung findet am Ende der Annealing-Phase in jedem Zyklus statt. Auch hier kann sich eine Schmelzkurvenanalyse anschließen.
mini|zentriert|800px|Quantifizierung von Nukleinsäuren mit Hilfe der qPCR und LightCycler-Sonden: (1) Einsatz von LightCycler-Sonden, die mit 2 verschiedenen FRET-Fluorophoren markiert wurden. (2) Während eines PCR-Zyklus hybridisieren die Sonden mit dem komplementären DNA-Strang und ermöglichen somit eine Fluoreszenz des Akzeptors. (3) Die Akzeptor-Fluoreszenz (hier der Reporter) steigt proportional mit der Konzentration komplementärer DNA.
LoopTag-Sonden Das FRET-Prinzip kommt ebenfalls beim LoopTag-Sondensystem zum Einsatz. Dieses System besteht aus dem Vorwärtsprimer, an dessen 5‘-Ende eine sequenzunspezifische Nukleotidsequenz und der Fluoreszenz-Akzeptor gekoppelt ist. Der andere Teil ist die Detektionssonde (LoopTag-Sonde), an die am 3‘-Ende eine sequenzunspezifische Nukleotidsequenz und der Donor gekoppelt ist. Die LoopTag-Sonde hybridisiert mit ihrem 5‘-Ende spezifisch an der Zielsequenz und am 3‘-Ende spezifisch am verlängerten Vorwärtsprimer. Die sequenzunspezifischen Nukleotidsequenzen der Detektionssonde und des Vorwärtsprimers hybridisieren unter Ausbildung einer Sonden-Primer-Schleife miteinander und bilden einen Stamm. Durch die daraus resultierende räumliche Nähe der endständigen Farbstoffe (Donor/Sonde, Akzeptor/Primer) kann der Energietransfer erfolgen.
TaqMan-Sonden (auch Hydrolyse-Sonden) Eine weitere häufig genutzte Möglichkeit des FRET besteht in der Anwendung einer Sonde, die an einem Ende mit einem Quencher, am anderen Ende mit einem Reporter-Fluoreszenzfarbstoff (z. B. TAMRA und FAM) markiert wurde (Double-Dye-Oligos, TaqMan-Sonde). Wenn die Taq-Polymerase, die zusätzlich zur Polymeraseaktivität eine 5'-3'-Exonuklease-Aktivität besitzt, die Sonde während der Synthese des Gegenstranges am 5'-Ende abbaut, entfernen sich dadurch Quencher und Fluorophor voneinander, und eine steigende Reporter-Fluoreszenz kann gemessen werden. Die Messung findet am Ende der Elongation in jedem Zyklus statt.
mini|zentriert|800px|Quantifizierung von Nukleinsäuren mit Hilfe der Real-time-PCR und TaqMan-Sonden. (1) Die Fluoreszenz des Reporter-Fluorophors wird bei intakten TaqMan-Sonden durch einen Quencher durch strahlungsfreie Energieübertragung (FRET) unterdrückt. (2) Während eines PCR-Zyklus hybridisiert die Sonde mit dem komplementären DNA-Strang, die Reporter-Fluoreszenz bleibt zunächst unterdrückt. (3) Die Taq-Polymerase baut auf Grund ihrer 5'-3'-Exonucleaseaktivität das 5'-Ende der Sonde während der PCR-Zyklen ab. Die Fluoreszenz des Reporters wird nun nicht mehr durch den Quencher gelöscht und kann gemessen werden.
Molecular Beacons mini|260px|Real-time quantitative PCR mit Hilfe von Molecular Beacons als Sonden. Eine weitere Möglichkeit der Echtzeit-Quantifizierung von PCR-Produkten unter Ausnutzung des FRET bietet die Nutzung von Molecular Beacons als Sonden. Molecular Beacons sind Oligonukleotide, die sowohl mit einem Reporter-Fluorophor als auch mit einem Quencher gekoppelt sind. Die Nukleotide am 5'-Ende der Sonde sind zu denen am 3'-Ende komplementär, so dass sich eine für Molecular Beacons charakteristische Sekundärstruktur ausbilden kann. In diesem als stem loop (Haarnadelstruktur) bezeichneten Zustand zeigt der Reporter durch seinen geringen Abstand zum Quencher keine Fluoreszenz. Durch Anlagerung der Schleifen-Region an eine komplementäre DNA-Sequenz während eines PCR-Zyklus wird der Abstand zwischen Quencher und Reporter vergrößert. Eine Reporter-Fluoreszenz kann somit beobachtet werden.
Scorpion-Primer mini|260px|Scorpion-Primer. Scorpion-Primer sind komplexe Oligonukleotide, welche die Eigenschaften von Real-Time-PCR-Sonden und PCR-Primern in einem (Uni-Scorpion) oder zwei Molekülen (Bi-Scorpion) vereinigen. Ähnlich den Molecular Beacons besitzen sie eine charakteristische Sekundärstruktur mit einer selbstkomplementären Schaft-Region, deren Enden mit einem Reporter-Fluorophor und einem Quencher modifiziert wurden. Zusätzlich tragen diese Sonden am 3'-Ende einen PCR-Primer. Während eines PCR-Zyklus kann mit steigender DNA-Konzentration eine Reporter-Fluoreszenz durch Anlagerung der Loop-Region an eine komplementäre DNA-Sequenz und damit vergrößerten Abstand zwischen Quencher und Reporter beobachtet werden.
Lux-Primer Lux-Primer sind mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierte Oligonucleotide, deren Fluoreszenzintensität von ihrer jeweiligen chemischen Umgebung abhängt. Werden diese Primer während einer PCR in eine DNA eingebaut, kann eine Zunahme der Fluoreszenz beobachtet werden.
Lanthanoid-markierte Sonden Lanthanoid-markierte Sonden sind an ihrem 5'-Ende mit einem Lanthanoid wie Europium oder Terbium markiert und mit einem Oligonukleotid hybridisiert, das am 3'-Ende mit einem Quencher markiert ist.J. Nurmi, T. Wikman, M. Karp, T. Lövgren: High-performance real-time quantitative RT-PCR using lanthanide probes and a dual-temperature hybridization assay. In: Analytical chemistry. Band 74, Nummer 14, Juli 2002, S. 3525–3532, . PMID 12139064.A. Lehmusvuori, A. H. Tapio, P. Mäki-Teeri, K. Rantakokko-Jalava, Q. Wang, H. Takalo, T. Soukka: Homogeneous duplex polymerase chain reaction assay using switchable lanthanide fluorescence probes. In: Analytical biochemistry. Band 436, Nummer 1, Mai 2013, S. 16–21, . doi:10.1016/j.ab.2013.01.007. PMID 23353013.
Quantifizierung Verschiedene Rechenmodelle werden für die Quantifizierung herangezogen, wobei meistens ein Referenz-Gen (z. B. GAPDH, Actin, Tubulin) mitgemessen wird, um einen relativen Menge-Vergleich durchzuführen (relative Quantifizierung). Andere, weitaus kompliziertere Methoden sollen eine absolute Quantifizierung ermöglichen, bei der die genaue Anzahl der in der Probe vorhandenen Templates bestimmt werden kann.
Ct-Wert oder auch Cp-Wert