mini|Mikroskopische Aufnahmen eines Blattes des Mooses Plagiomnium undulatum. Oben Hellfeldmikroskopie, unten eine fluoreszenzmikroskopische Aufnahme. Die rote Autofluoreszenz der Chloroplasten ist gut zu erkennen. Die Fluoreszenzmikroskopie ist eine spezielle Form der Lichtmikroskopie. Sie beruht auf dem physikalischen Effekt der Fluoreszenz. Wenn fluoreszierende Stoffe mit Licht bestimmter Wellenlängen angeregt werden, strahlen sie Licht anderer, längerer Wellenlängen ab (Stokes-Verschiebung).
Bei der Fluoreszenzmikroskopie wird das erzeugte, vergrößerte Bild des untersuchten Objekts nur durch abgestrahltes (emittiertes) Licht erzeugt. Farbfilter verhindern, dass Anregungslicht auf das Bild gelangt. Fluoreszenzmikroskopische Bilder sind dann informativ, wenn nicht das ganze mikroskopische Präparat gleichmäßig fluoresziert, sondern wenn nur einige Strukturen leuchten. Diese Strukturen erzeugen helle Signale vor dunklem Hintergrund.
Jedes fluoreszierende Molekül im Präparat kann dabei als neue Lichtquelle angesehen werden. Liegt die Intensität der von diesen Molekülen abgestrahlten Fluoreszenz über der Nachweisgrenze, können mit der Fluoreszenzmikroskopie auch Strukturen nachgewiesen werden, die weit kleiner sind als die Auflösungsgrenze des Mikroskops. Die Auflösungsgrenze wird bei der klassischen Fluoreszenzmikroskopie aber nicht überwunden, da bei kleinem Abstand zwar ein Nachweis möglich ist, aber keine Aussage darüber, ob das Signal von einer oder von mehreren Strukturen hervorgerufen wird. In dieser Hinsicht besteht Ähnlichkeit zur Dunkelfeldmikroskopie.
Neben der klassischen gibt es zahlreiche weiterentwickelte Spezialformen der Fluoreszenzmikroskopie. Hierzu gehören beispielsweise die konfokale Laserscanningmikroskopie und die Multi-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie. Ab den 1990er-Jahren wurden verschiedene Verfahren entwickelt, die tatsächlich eine deutlich verbesserte Auflösung ermöglichen. Diese sogenannten Höchstauflösungs- oder Superresolution-Verfahren sind ebenfalls fluoreszenzmikroskopischer Art.
Grundlagen Fluoreszenz
mini|links|Jablonski-Diagramm, das die Energieniveaus veranschaulicht. Die Anregung hebt ein Elektron von einem der Grundzustände auf einen der angeregten Zustände. Bei der Fluoreszenzemission fällt es vom niedrigsten angeregten Zustand auf einen der Grundzustände. mini|Anregungs- (schwarz) und Emissionsspektrum (rot) von Fluorescein. Es wird am effektivsten mit Licht einer Wellenlänge von ca. 490 nm angeregt und strahlt am hellsten bei 520 nm. Ein fluoreszierendes Molekül hat ein Elektron, das durch Absorption eines Photons von einem energiearmen Grundzustand (S0) in einen energiereicheren, angeregten Zustand (S1) übergehen kann. Sowohl S0 als auch S1 haben mehrere Unterzustände, die sich jeweils im Gehalt der Schwingungsenergie (auch: Vibrationsenergie) des Elektrons unterscheiden. Der Energieunterschied zwischen dem Ausgangs-Schwingungszustand innerhalb von S0 und dem erreichten Schwingungszustand in S1 entspricht genau dem Energiegehalt des absorbierten Photons.
Fällt das Elektron auf einen Grundzustand zurück, wird ein Photon ausgesendet. Diese Lichtemission erfolgt wenige Nanosekunden nach der Absorption – das ist die Fluoreszenz. Damit sie zustande kommt, muss zwischen S0 und S1 ein deutlicher Unterschied im Energiegehalt liegen und es dürfen keine weiteren Energieniveaus dazwischen liegen, da angeregte Elektronen sonst über nichtstrahlende Prozesse in den Grundzustand zurückkehren.
Da sowohl der Grundzustand S0 als auch der angeregte Zustand S1 mehrere Unterzustände haben, können nicht nur Photonen mit genau einem bestimmten Energiegehalt absorbiert oder emittiert werden, sondern auch Photonen mit ähnlichen Energiegehalten. Da sich der Energiegehalt eines Photons umgekehrt proportional zu seiner Wellenlänge verhält, bedeutet das, dass ein fluoreszierender Stoff durch einige ähnliche Wellenlängen angeregt wird: Man spricht vom Anregungsspektrum. Genauso strahlt er einige ähnliche Wellenlängen ab, das Emissionsspektrum.
Das Abstrahlen der Fluoreszenz geschieht grundsätzlich vom niedrigsten angeregten Energieniveau aus (Kasha-Regel). Wird das Elektron durch die Absorption des Anregungsphotons auf einen höheren angeregten Zustand gehoben, so gelangt es zunächst durch nichtstrahlende Energieabgabe auf das niedrigste angeregte Energieniveau, bevor es zur Emission eines Photons kommt. Dies hat für die Fluoreszenzmikroskopie mehrere wichtige Konsequenzen: Die emittierten Photonen sind im Mittel deutlich energieärmer und daher zum roten Ende des Lichtspektrums verschoben. Dieser Effekt wird als Stokes-Verschiebung bezeichnet. Der Energieunterschied verbleibt als Schwingungsenergie, also Wärme im Präparat. Die spektrale Verteilung des abgegebenen Fluoreszenzlichts ist unabhängig von der Wellenlänge des Anregungslichts. Die Zeitdauer von der Absorption über das Erreichen des niedrigsten angeregten Zustands bis zur Abgabe des Photons hat für einen fluoreszierenden Stoff eine charakteristische Verteilung. Sie wird als Fluoreszenzlebensdauer bezeichnet und ist die Grundlage der Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie. Stoffe, die fluoreszieren, werden als Fluorophore bezeichnet. Fluorophore, die verwendet werden um Präparate anzufärben, werden als Fluoreszenzfarbstoffe oder Fluorochrome bezeichnet.
Autofluoreszenz und Fluorochrome mini|Pollenkorn von Hibiskus. Autofluoreszenz angeregt mit 405 nm und aufgezeichnet in drei Farbkanälen. Projektion von konfokalen Bildern. Der weiße Balken ist 170 µm lang.
Wenn ein Präparat von selbst fluoresziert, wird dies als Autofluoreszenz, Eigenfluoreszenz oder Primärfluoreszenz bezeichnet. Viele Pflanzen haben in verschiedenen Teilen sehr starke Autofluoreszenz, zum Beispiel Samenpflanzen in den hölzernen Teilen ihrer Sprossachsen. Das Chlorophyll in den Chloroplasten der grünen Pflanzenzellen ist stark rot fluoreszierend. Tierische Zellen fluoreszieren im Vergleich dazu nur schwach, jedoch noch stark genug, um Fluoreszenzmarkierungen unter Umständen zu verschleiern. Die Hauptquellen hier sind Flavine, die in den Mitochondrien vorkommen und Lipofuscin in den Lysosomen. Das Coenzym NADPH zeigt ebenfalls Autofluoreszenz.I. Georgakoudi, B. C. Jacobson, M. G. Müller, E. E. Sheets, K. Badizadegan, D. L. Carr-Locke, C. P. Crum, C. W. Boone, R. R. Dasari, J. Van Dam, M. S. Feld: NAD(P)H and collagen as in vivo quantitative fluorescent biomarkers of epithelial precancerous changes. In: Cancer research. Band 62, Nummer 3, Februar 2002, S. 682–687, PMID 11830520.
Eine in einem Präparat mit Fluorochromen künstlich erzeugte Fluoreszenz ist eine Sekundärfluoreszenz. Der Prozess, der dazu führt, heißt Fluoreszenzmarkierung. Gute Fluorochrome vereinigen mehrere Eigenschaften: (1) Sie haben eine hohe Wahrscheinlichkeit ein Photon zu absorbieren, das heißt, sie haben einen hohen Absorptionskoeffizienten. (2) Die meisten der absorbierten Photonen führen tatsächlich zur Emission eines Flureszenzphotons (hohe Quanteneffizienz). Beides zusammen führt zu einer großen Helligkeit. (3) Fluorochrome sollten ein geringes Bleichen aufweisen, das heißt, dass sie sich oft anregen lassen, ohne zerstört zu werden. (4) Außerdem sollten Fluorochrome in einem möglichst schmalen Bereich des Lichtspektrums fluoreszieren, damit möglichst viele Fluorochrome mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarben gleichzeitig verwendet werden können, um unterschiedliche Strukturen anzufärben.
Farbkanäle mini|Markierung von menschlichen Chromosomen in einem Zellkern mit sieben verschiedenen Fluorochromen Wenn sich die Anregungs- und Emissionsspektren zweier Fluorochrome stark überlappen, dann können diese nicht voneinander unterschieden werden. Beispielsweise haben Fluorescein, Grün fluoreszierendes Protein, Spectrum Green und eine Reihe weiterer kommerziell erhältlicher Farbstoffe sehr ähnliche Spektren, so dass sie anhand ihrer Fluoreszenzfarbe nicht unterschieden werden können. Wenn verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe nebeneinander eingesetzt werden sollen, um verschiedene Strukturen anzufärben, müssen diese Farbstoffe unterschiedliche Spektren haben. Typischerweise regt UV-Licht blau fluoreszierende Fluorochrome an, blaues Licht grüne Fluorochrome und grünes Licht rote Fluorochrome. Diese drei Farbkanäle lassen sich also verwenden, um im gleichen Präparat unterschiedliche Strukturen darzustellen.
Damit ist die Zahl der gleichzeitig nachweisbaren Farben jedoch nicht erschöpft. Acht verschiedene Fluorochrome wurden bereits parallel eingesetzt. Dazu verwendete man DAPI als blau fluoreszierende Gegenfärbung für DNA sowie sieben weitere Farbstoffe, die an Gensonden für Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung gekoppelt wurden: Diethylaminocoumarin (Deac), Spectrum Green und die Cyanin-Farbstoffe Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5 und Cy7.M. R. Speicher, S. Gwyn Ballard, D. C. Ward: Karyotyping human chromosomes by combinatorial multi-fluor FISH. In: Nature genetics. Band 12, Nummer 4, April 1996, S. 368–375, doi:10.1038/ng0496-368. PMID 8630489.A. Bolzer, G. Kreth, I. Solovei, D. Koehler, K. Saracoglu, C. Fauth, S. Müller, R. Eils, C. Cremer, M. R. Speicher, T. Cremer: Three-dimensional maps of all chromosomes in human male fibroblast nuclei and prometaphase rosettes. In: PLoS biology. Band 3, Nummer 5, Mai 2005, S. e157, doi:10.1371/journal.pbio.0030157. PMID 15839726, . Die meisten Fluoreszenzmikroskope haben drei bis fünf Farbkanäle.
Aufbau von Fluoreszenzmikroskopen Bei der „normalen“ Lichtmikroskopie, der Durchlicht-Hellfeldmikroskopie, wird das Bild durch Licht erzeugt, welches das Präparat durchstrahlt. Dies ist bei der Fluoreszenzmikroskopie nicht der Fall. Hier wird das Bild durch Fluoreszenzlicht erzeugt, das erst im Präparat entsteht. Das Anregungslicht, welches das Präparat bestrahlt, wird dagegen durch spezielle Filter von der Bilderzeugung ausgeschlossen. Da sich Fluoreszenzlicht unter normalen Bedingungen gleichmäßig in alle Raumrichtungen ausbreitet, ist es daher grundsätzlich egal, ob das Anregungslicht von oben, von unten oder von der Seite kommt. Tatsächlich wurden alle drei Varianten umgesetzt.
Zu Beginn der Fluoreszenzmikroskopie, in der ersten Hälfte des 20. Jahrhunderts, wurden Durchlicht-Fluoreszenzmikroskope gebaut. Sie sind heute nur noch von historischem Interesse (siehe Abschnitt Geschichte unten). Durch die Verfügbarkeit Dichroitischer Spiegel (auch: dichroitischer Strahlteiler) wurde es ab etwa 1970 möglich, Auflicht-Fluoreszenzmikroskope zu bauen, bei denen das Anregungslicht über das Objektiv in das Präparat eingestrahlt wird. Sie werden auch Epifluoreszenzmikroskope genannt, nach griechisch für „auf“. Seit Ende des 20. Jahrhunderts wird dieser Bautyp fast ausschließlich verwendet. Die seitliche Beleuchtung findet bei einem spezialisierten Fluoreszenzmikroskop Anwendung, dem Lichtscheibenmikroskop (siehe unten).
Das Epifluoreszenzmikroskop: das typische Fluoreszenzmikroskop Im Vergleich zu Durchlicht-Hellfeldmikroskopen haben Epifluoreszenzmikroskope eine zusätzliche Auflicht-Beleuchtungsachse für das Fluoreszenz-Anregungslicht. Das zu beobachtende Objekt wird durch das Objektiv beleuchtet. Die folgende Nummerierung bezieht sich auf die Schemazeichnung. Durch einen passend ausgewählten optischen Filter, den Anregungsfilter, wird von der verwendeten Lampe nur der Teil des erzeugten Lichts durchgelassen, der die für die Anregung des Fluoreszenzfarbstoffs notwendigen Wellenlängen enthält. Der Bereich des Spektrums, in welchem der Fluoreszenzfarbstoff leuchtet, darf vom Anregungsfilter nicht durchgelassen werden. Ein Strahlteiler spiegelt das Anregungslicht zum Objektiv, worauf im Präparat die Fluoreszenz entsteht. Das Objektiv übernimmt also auch die Funktion des Kondensors. Die Fluoreszenz ist langwelliger als das Anregungslicht.