mini|Animation der abstandsabhängigen Energieübertragung von einem angeregten Donor auf einen Akzeptor über den Förstermechanismus.
Der Förster-Resonanzenergietransfer (kurz FRET), manchmal auch (fälschlich) Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer genannt, ist ein nach Theodor Förster benannter physikalischer Prozess der Energieübertragung. Im Rahmen des Förster-Resonanzenergietransfers wird die Energie eines angeregten Farbstoffs, auch Donor genannt, auf einen zweiten Farbstoff, auch Akzeptor genannt, übertragen. Die Energie wird dabei strahlungsfrei und somit nicht über eine Abgabe (Emission) und Aufnahme (Absorption) von Lichtteilchen (Photonen) ausgetauscht. Auf dem Förster-Resonanzenergietransfer basiert beispielsweise der Lichtsammelkomplex Photosynthese betreibender Organismen. In der Biochemie und der Zellbiologie findet der Förster-Resonanzenergietransfer insbesondere unter Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen als „optisches Nanometermaß“ Anwendung, da die Intensität unter anderem vom Abstand von Donor und Akzeptor abhängt und im Bereich von bis zu 10 nm beobachtet werden kann.
Geschichte mini|James Franck beschrieb (gemeinsam mit G. Cario) 1922 einen strahlungsfreien Energietransfer Die Geschichte der Entdeckung und Erforschung des Förster-Resonanzenergietransfers lässt sich weit über Theodor Försters Aufsatz „Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz“, der 1948 in den Annalen der Physik veröffentlicht wurde, zurückverfolgen. Wichtige Grundlagenerkenntnisse für die spätere wissenschaftliche Beschreibung dieses Phänomens lieferten bereits ab dem frühen 19. Jahrhundert Hans Christian Ørsted, Michael Faraday, James Clerk Maxwell und Heinrich Hertz.
Erste experimentelle Hinweise auf einen Energietransfer zwischen zwei Molekülen gelang 1922 G. Cario und James Franck. Sie beobachteten in einem Quecksilber-Thallium-Dampfgemisch eine charakteristische, von ihnen als „sensibilisierte Fluoreszenz“ bezeichnete Lichtabgabe von Thallium nach einer Anregung mit Licht einer Wellenlänge, die spezifisch für die Anregung von Quecksilber ist. Erste Versuche der Erklärung dieses Energietransfers von Jean-Baptiste Perrin und Francis Perrin beruhen auf einem sogenannten Nahfeld-Dipol-Dipol-Mechanismus. Hartmut Kallman und Fritz London fanden eine quantenmechanische Erklärung für diesen strahlungsfreien Energietransfer. Diese Erkenntnisse flossen in Francis Perrins Versuch einer quantitativen Beschreibung dieses Energietransfers ein. Sie beruhte jedoch auf der Fehlannahme, dass der Energietransfer mit der dritten und nicht mit der sechsten Potenz des Abstands beider Moleküle abnimmt.
Theodor Förster beteiligte sich 1946 kurz nach dem Zweiten Weltkrieg an der Diskussion zur quantitativen Beschreibung des strahlungsfreien Energietransfers. Doch erst sein Aufsatz „Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz“ aus dem Jahr 1948 fand ein breites Echo in der Wissenschaft.
Physik mini|Jablonski-Energiediagramm des FRET am Beispiel von CFP und YFP Der Förster-Resonanzenergietransfer kann zwischen zwei Farbstoffen, die als Moleküle, Komplexe oder Nanopartikel vorliegen, beobachtet werden. Dabei wird die Energie eines angeregten Donorfarbstoffs nicht in Form eines Photons abgegeben, sondern strahlungslos über Dipol-Dipol-Wechselwirkungen auf einen Akzeptorfarbstoff übertragen. Während das Coulombsche Gesetz für Monopole gilt, ist hier die elektrische Dipol-Dipol-Wechselwirkung für den Energietransfer verantwortlich, weshalb der Transfer auch von der sechsten Potenz des Abstands abhängt. Beschreibungen des Förster-Resonanzenergietransfers mit Hilfe der klassischen Physik oder der Quantenmechanik führen zu vergleichbaren Ergebnissen. Demnach induziert der angeregte Donor D* eine Oszillation im Akzeptor A. Charakteristisch für den Förster-Resonanzenergietransfer ist auch, dass die quantenmechanische Eigenschaft des Spins von Donor- und Akzeptorfarbstoff erhalten bleibt. Daher tritt der Förster-Resonanzenergietransfer in der Regel als sogenannter Singulett-Singulett-Transfer auf:
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Dem gegenüber treten Energietransfers, die lediglich unter Erhaltung des Gesamtspins von Donor- und Akzeptorfarbstoff erfolgen, als ein auf einem Austausch von Elektronen basierenden Dexter-Energietransfer im Bereich von unter 2 nm Abstand auf.
Die auf den Akzeptorfarbstoff übertragene Energie kann von diesem beispielsweise in Form von Strahlung wieder abgegeben werden. Dem Donorfarbstoff hingegen steht die transferierte Energie nicht mehr für eine direkte Strahlungsabgabe zur Verfügung. Ebenso nimmt die Verweildauer des Donorfarbstoffs im angeregten Zustand ab. Makroskopisch äußert sich ein Förster-Resonanzenergietransfer anhand der Abnahme der Strahlungsintensität und der Fluoreszenzlebensdauer der Donorfarbstoffe sowie bei zur Strahlung befähigten Akzeptorfarbstoffen anhand einer Zunahme der Strahlungsintensität der Akzeptorfarbstoffe.
Donor und Akzeptor sind zumeist Fluoreszenzfarbstoffe, weshalb oft der Begriff Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer als Synonym verwendet wird. Fluoreszenz ist jedoch keine essenzielle Voraussetzung und am Energietransfer nicht beteiligt. Auch zwischen Donoren, die zu anderen Formen der Strahlung, wie Phosphoreszenz, Biolumineszenz oder Chemolumineszenz, befähigt sind, und geeigneten Akzeptorfarbstoffen kann ein Förster-Resonanzenergietransfer beobachtet werden. Akzeptorfarbstoffe dürfen sogar nicht-emissiv sein und können zur Fluoreszenzlöschung führen (dark quencher).
FRET-Effizienz Die Effizienz des Förster-Resonanzenergietransfers , die Werte zwischen 0 und 1 annehmen kann, ist das Verhältnis aus der Anzahl an Energietransfers und der Anzahl der Donoranregungen. Sie spiegelt sich auch in der Förster-Resonanzenergietransferrate im Verhältnis zur Summe der Raten für Strahlungsemission des Donorfarbstoffs , Energietransfer und der Formen strahlungsfreien Abbaus wider:
Um eine möglichst effiziente strahlungsfreie Energieübertragung vom Donorfarbstoff auf den Akzeptorfarbstoff über den Förster-Resonanzenergietransfer zu ermöglichen, müssen drei wesentliche Kriterien erfüllt sein: Abstand: Donorfarbstoff und Akzeptorfarbstoff sollten nur wenige Nanometer voneinander entfernt sein. Spektrum: Das Strahlungsemissionsspektrum des Donorfarbstoffs muss mit dem Absorptionsspektrum des Akzeptorfarbstoffs überlappen. Orientierung: Donor- und Akzeptorfarbstoff sollten möglichst parallele elektronische Schwingungsebenen haben.
Abstand mini|Voraussetzung für FRET: Abstand < 10 nm Das Ausmaß des Förster-Energietransfers, dargestellt als die Transferrate , ist von der Strahlungsemissionsrate des Donorfarbstoffs oder dessen Verweildauer im angeregten Zustand (Fluoreszenzlebensdauer) und in besonderer Weise vom Abstand zwischen Donor- und Akzeptorfarbstoff abhängig. Üblicherweise liegt dieser bei einem Förster-Resonanzenergietransfer im Bereich von etwa 0,5 bis 10 nm, wobei die Effizienz des Energietransfers mit der sechsten Potenz des Abstands beider Farbstoffe abnimmt.
Die Transferrate wird zudem vom Förster-Radius des Donor-Akzeptorfarbstoff-Paars bestimmt. entspricht dem Abstand zwischen beiden Farbstoffen, bei dem die Energieübertragung zu 50 % erfolgt:
Damit unterscheidet sich der Förster-Resonanzenergietransfer von einer Energieübertragung, die auf einer reinen Emission und Absorption von Strahlung beruht und die mit dem Quadrat des Abstands von Donor und Akzeptor abnimmt. Ebenso unterscheidet er sich von dem insbesondere bei sehr kleinen Abständen (< 0,5 nm) zu beobachtenden Dexter-Elektronentransfer, der auf einem Überlappen der Elektronenorbitale beruht und exponentiell mit dem Abstand abnimmt.
Das Kriterium des geringen Abstandes zwischen Donor und Akzeptor führt dazu, dass der Förster-Resonanzenergietransfer oft als „optisches Nanometermaß“ genutzt wird. Seine Nutzung erlaubt eine Abstandsmessung eines Donors zu seinem Akzeptor im Bereich des Nahfelds deutlich unterhalb des Auflösungsvermögens konventioneller optischer Verfahren, wie der Mikroskopie. Daher hat sich die Nutzung des Förster-Resonanzenergietransfers insbesondere in der Biochemie und der Zellbiologie als eine wertvolle Methode etabliert.
Spektren mini|Voraussetzung für FRET: Überlappung der Spektren von Donoremission und Akzeptorabsorption Eine Voraussetzung für einen Energietransfer ist, dass der Akzeptorfarbstoff zur Energieaufnahme befähigt ist. Dazu muss die zu transferierende Energiemenge, welche der Energiedifferenz aus angeregtem Zustand und Grundzustand entspricht, im Bereich der möglichen Energieaufnahme des Akzeptorfarbstoffs liegen. Dies ist gegeben, wenn das Emissionsspektrum des Donorfarbstoffs mit dem Absorptionsspektrum des Akzeptorfarbstoffs überlappt. Die Größe der überlappenden Fläche der Spektren von Donor- und Akzeptorfarbstoff, dargestellt als das Integral , ist proportional zur Transferrate und zur sechsten Potenz des Förster-Radius :
,
wobei die normierte Strahlungsintensität des Donorfarbstoffs bei der Wellenlänge und der Extinktionskoeffizient des Akzeptorfarbstoffs ist.
Orientierung mini|Voraussetzung für FRET: Orientierung der Schwingungsebenen Für einen optimalen Energietransfer sollten Donor- und Akzeptorfarbstoff möglichst parallele elektronische Schwingungsebenen haben. Die Transferrate und die sechste Potenz des Förster-Radius des Donor-Akzeptor-Paars sind proportional zum Orientierungsfaktor :
,
wobei der Winkel zwischen dem Emissionsdipol des Donorfarbstoffs und dem Absorptionsdipol des Akzeptorfarbstoffs sowie und die Winkel zwischen beiden Dipolen und dem Verbindungsvektor zwischen Donor- und Akzeptorfarbstoff sind. kann Werte zwischen 0 und 4 annehmen, wobei der Wert 0 bei Rechtwinkligkeit (Orthogonalität) der Dipole und der Wert 1 bei parallel und der Wert 4 bei kollinear angeordneten Dipolen erreicht wird. Für frei bewegliche Farbstoffe, beispielsweise bei Untersuchung von Prozessen in Lösung, beträgt . Sind hingegen Donor- und Akzeptorfarbstoff fixiert (z. B. am selben Protein oder in Membranen), so kann von diesem Wert abweichen und der Förster-Resonanzenergietransfer kann Aufschluss über die Änderung der Schwingungsebenen und damit der Lage beider Farbstoffe zueinander geben.
Messung Da der Förster-Resonanzenergietransfer ein strahlungsfreier Energietransfer ist, lässt er sich nicht direkt nachweisen und quantifizieren. Jedoch können die Folgen eines Energietransfers, die Abnahme der Strahlungsintensität und der Fluoreszenzlebensdauer des Donorfarbstoffs sowie bei zur Strahlungsabgabe befähigten Akzeptorfarbstoffen die Akzeptoremission, mit Hilfe geeigneter instrumenteller Methoden nachgewiesen werden. Für diesen Zweck eignen sich beispielsweise Fluoreszenzmikroskope oder Fluorimeter. Um einen auf dem Förster-Mechanismus beruhenden Energietransfer nachzuweisen, muss streng genommen auch eine umgekehrte Proportionalität zwischen der Energietransferrate und der sechsten Potenz des Abstands beider Farbstoffe vorliegen. In der Praxis, insbesondere in der Biochemie, wird jedoch die Art des Energietransfers nur selten geprüft.
Messung der Strahlungsemission des Donors mini|Zunahme der Akzeptorfluoreszenz und Abnahme der Donorfluoreszenz nach Annäherung der Farbstoffe CFP und YFP ab t0 mini|Zunahme der Donorfluoreszenz nach Photobleichung des Akzeptors Da der Förster-Resonanzenergietransfer zu einer Abnahme der Strahlungsemission des Donorfarbstoffs führt, eignet sich dessen Messung für eine Detektion eines Resonanzenergietransfers. Eine Quantifizierung der FRET-Effizienz erfolgt durch Messung der Strahlungsintensität des Donorfarbstoffs in Ab- und in Anwesenheit des Akzeptorfarbstoffs :