Die UV/VIS-Spektroskopie ist ein spektroskopisches Verfahren der optischen Molekülspektroskopie, das elektromagnetische Wellen des ultravioletten (UV) und des sichtbaren (, VIS) Lichts nutzt. Die Methode ist auch unter UV/VIS-Spektralphotometrie oder als Elektronenabsorptionsspektroskopie bekannt. Im Alltag werden die verwendeten Geräte häufig ungenau als Photometer bezeichnet.
Die UV/VIS-Spektroskopie umfasst einen relativ kleinen Wellenlängenbereich des elektromagnetischen Spektrums von etwa 200 nm bis 800 nm. Für Routineanwendungen in der organischen Chemie wird der folgende Bereich verwendet: : 180-800 nm, : 55.556-12.500 cm−1. Die Energie dieser Strahlung ist in der Lage, die Valenzelektronen der Atome auf ein höheres Energieniveau zu heben.
mini|UV-VIS-NIR-Transmissionsspektrum eines ein Zentimeter dicken Rubin-Kristalls
Prinzip UV/VIS-Spektroskopie beruht auf Messung der Extinktion von sichtbarem und ultraviolettem Licht durch eine Probe. Die spektrale, d. h. wellenlängenabhängige, Information kann entweder durch Selektion und Scannen der Wellenlänge des einfallenden Lichts vor der Probe (siehe unten, Zweistrahl-Spektrometer) oder durch Trennen der Wellenlängen des transmittierten Lichts nach der Probe (siehe unten, Diodenarray-Spektrometer) gewonnen werden. Das Verhältnis der spektralen Intensität des transmittierten und des einfallenden Lichts liefert das Transmissionspektrum. Der logarithmische Kehrwert der Transmission ergibt das Extinktionsspektrum.
Grundsätzlich liefert die Extinktion Informationen über die Absorption, Streuung, Beugung und Reflexion an und in der Probe. Häufig werden in der UV/VIS-Spektroskopie Erscheinungen der Strahlungsabsorption ausgewertet, da die Photonenenergie des sichtbaren und ultravioletten Lichts der Übergangsenergie der Zustände von äußeren Elektronen vieler Atome und Moleküle entspricht. Durch Absorption von Photonen im sichtbaren und ultravioletten Spektralbereich können Valenzelektronen (beispielsweise die der p- und d-Orbitale) angeregt werden, das heißt, in einen Zustand höherer Energie übergehen. Das Transmissions- oder Extinktionsspektrum erlaubt daher die Identifikation und quantitative Bestimmung von Analyten.
Um ein Elektron beispielsweise von einem besetzten (HOMO) auf ein unbesetztes, höheres Orbital (LUMO) anzuheben, muss die Energie des absorbierten Photons genau der Energiedifferenz zwischen den beiden Energieniveaus entsprechen. Über den Zusammenhang
kann die Wellenlänge des absorbierten Lichtes für die aufzuwendende Energie berechnet werden, wobei die Energie, die Planck-Konstante, die Lichtgeschwindigkeit, die Frequenz und die Wellenlänge der elektromagnetischen Welle sind. Dieser Zusammenhang wird manchmal auch als Einstein-Bohr-Gleichung bezeichnet. Näherungsweise lässt sich dieser Zusammenhang in Form einer zugeschnittenen Größengleichung vereinfacht darstellen:
Stoffe, die nur im UV-Bereich ( < 400 nm) absorbieren, erscheinen dem menschlichen Auge farblos. Einen Stoff nennt man dann farbig, wenn er Strahlung im Bereich des sichtbaren Spektrums absorbiert. Dies ist sowohl bei Verbindungen zu erwarten, die über niedrige Anregungsenergien verfügen (π-zu-π*-Übergänge, konjugierten π-Elektronensystemen wie beispielsweise bei den Polyenen), als auch bei anorganischen Ionenkomplexen mit unvollständig aufgefüllten Elektronenniveaus (Beispiel: Cu2+-Verbindungen (meist bläulich – grünlich) gegenüber farblosen Cu+-Verbindungen). Ebenfalls erscheinen Verbindungen farbig, wenn stark polarisierende Wechselwirkungen zwischen benachbarten Teilchen bestehen, wie es z. B. beim gelben AgI der Fall ist. Bei nur einem Absorptionsgebiet nimmt das Auge die zur absorbierten Strahlung komplementäre Farbe wahr.
Die Stärke der UV/VIS-Absorption einer Substanz ist für die Interpretation des Spektrums relevant. Die Extinktion (Absorbanz des Materials für Licht der Wellenlänge ) ist gegeben durch das Lambert-Beersches Gesetz:
ist die Schichtdicke des durchstrahlten Körpers (Einheit: m). Hierbei ist der dekadischer Extinktionskoeffizient (oft auch als spektraler Absorptionskoeffizient bezeichnet), welcher eine wellenlängenabhängige Stoffkonstante ist. Er wird in der Einheit bzw. angegeben. Als Ordinatengröße für UV/VIS-Spektren wird bzw. , wenn sich der -Wert im Spektrum über mehrere Zehnerpotenzen ändert, häufig verwendet.
Anwendungen mini|UV/VIS-Spektrum eines Chrom(III)-Komplexes Die UV/VIS-Spektroskopie wird in der analytischen Chemie routinemäßig zur quantitativen Bestimmung verschiedener Analyten oder Proben eingesetzt, z. B. von Übergangsmetallionen, stark konjugierten organischen Verbindungen und biologischen Makromolekülen. Spektroskopische Analysen werden in der Regel in Lösungen durchgeführt, aber auch Feststoffe und Gase können untersucht werden.
Quantitative Bestimmung Alle quantitativen Bestimmungen beruhen auf der Anwendung des Lambert-Beer’schen Gesetzes. Quantitative Bestimmungen werden durchgeführt bei
Konzentrationsbestimmungen, Bestimmung des molaren Extinktionskoeffizienten und reaktionskinetischen Messungen.
Qualitative Bestimmungen UV/VIS-Spektren dienen dazu, Vermutungen über die Struktur der gesuchten Substanz zu bestätigen oder einzuschränken. Das Spektrum gibt Auskunft über die Art des Chromophors. Aussagen über andere Strukturteile des Moleküls sind nicht möglich. Die Bestimmung von Chromophoren mit Hilfe eines UV/VIS-Spektrums ist deshalb oft schwierig und wird daher in Kombination mit zusätzlichen spektroskopischen Methoden (IR-Spektroskopie, NMR-Spektroskopie) durchgeführt.
Aufbau eines Zweistrahl-UV/Vis-Spektrometers mini|Spektrometer für Messungen zwischen 200 und 1100 nm Die Lichtquelle strahlt ultraviolettes, sichtbares und nahinfrarotes Licht im Wellenlängenbereich von etwa 200 nm bis 1100 nm aus. Im Monochromator wird zunächst die zur Messung ausgewählte Wellenlänge selektiert, worauf der Lichtstrahl auf den Sektorspiegel fällt. Der Sektorspiegel lässt das Licht abwechselnd durch die Messlösung und durch die Vergleichslösung fallen. Beide Lösungen befinden sich in sogenannten Küvetten. Die zwei Lichtstrahlen werden im Detektor empfangen und die Intensitäten im Verstärker verglichen. Der Verstärker passt dann die Intensität des Lichtstrahls aus der Vergleichslösung durch Einfahren der Kammblende der Intensität des Lichtstrahls aus der Messlösung an. Diese Bewegung wird auf einen Schreiber übertragen oder die Messwerte an eine Datenverarbeitung weitergegeben. mini|Schematischer Aufbau eines Zweistrahl-UV/Vis-Spektrometers Zunehmend werden küvettenfreie UV/VIS-Spektrometer zur Konzentrationsbestimmung kleiner Probevolumina (unter 2 Mikroliter) von Proben höherer Konzentrationen eingesetzt.H. Stranneheim, J. Lundeberg: Stepping stones in DNA sequencing. In: Biotechnology journal. Band 7, Nummer 9, September 2012, , S. 1063–1073, doi:10.1002/biot.201200153, PMID 22887891, .P. O. Michel, C. Degen, M. Hubert, L. Baldi, D. L. Hacker, F. M. Wurm: A NanoDrop-based method for rapid determination of viability decline in suspension cultures of animal cells. In: Analytical biochemistry. Band 430, Nummer 2, November 2012, , S. 138–140, doi:10.1016/j.ab.2012.08.028, PMID 22960013.M. T. Kelliher, M. S. Piraino, M. E. Gemoules, C. A. Southern: A comparison of Förster resonance energy transfer analysis approaches for Nanodrop fluorometry. In: Analytical biochemistry. Band 441, Nummer 1, Oktober 2013, , S. 44–50, doi:10.1016/j.ab.2013.06.009, PMID 23811157. Sogenannte Nanophotometer arbeiten mit Schichtdicken in Bereichen von 0,04 mm bis 2 mm. Sie benötigen keine Küvetten, keine Verdünnungen und können Proben mit einem Volumen von nur 0,3 µl analysieren (bei kleinster Schichtdicke), besitzen jedoch aufgrund der geringen Schichtdicke eine höhere Nachweisgrenze. Eine bewährte Technik basiert auf einer Kompression der Probe, welche somit unabhängig von der Oberflächenspannung und Verdunstung der Probe ist. Diese Methode findet Verwendung bei der Analyse von Nukleinsäuren (DNA, RNA, Oligonucleotide) und Proteinen (UV-Absorption bei 280 nm). Nach dem Lambert-Beer’schen Gesetz besteht ein Zusammenhang zwischen Absorption und Schichtdicke. Die Absorptionswerte bei den verschiedenen Schichtdicken (0,04 mm bis 2 mm) können somit berechnet werden. Geringe Schichtdicken wirken wie eine virtuelle Verdünnung der Probe, können jedoch nur bei entsprechend höheren Konzentrationen eingesetzt werden. Oftmals kann daher auf eine manuelle Verdünnung der Probe ganz verzichtet werden.
Aufbau eines Diodenarray-UV/VIS-Spektrometers alt=Funktionsprinzip eines Diodenarray-Spektrometers|mini|Funktionsprinzip eines Diodenarray-Spektrometers mini|Kompaktes Diodenarray-UV/VIS-Spektrometer Eine weitere Technologie ist die Diodenarray-Technologie. Die Probe in der Küvette wird mit einem Lichtstrahl bestrahlt, bestehend aus dem kontinuierlichen Wellenlängenbereich der Lichtquelle (z. B. Xenonblitzlichtlampe, 190 nm bis 1100 nm). Die Probe absorbiert bei einer Messung unterschiedliche Wellenlängen der Lichtquelle. Nicht absorbiertes Licht gelangt durch den Eintrittsspalt und wird an einem Beugungsgitter nach seiner Wellenlänge aufgespalten. Das Spektrum wird mithilfe eines CCD-Sensors detektiert und anschließend ausgewertet. Bei nicht automatisierten Geräten muss die Referenzprobe zusätzlich gemessen werden. Vorteile der Technologie sind kurze Messzeiten, da das gesamte UV/VIS-Spektrum mit einer Messung aufgenommen werden kann, ein niedriger Wartungsaufwand, da keine beweglichen Bauteile im Spektrometer vorhanden sind und dass die Geräte kompakt konstruiert werden können.
Theorie und chemische Beispiele Bei der UV/VIS-Spektroskopie handelt es sich um eine Elektronenspektroskopie, das heißt, es werden Elektronen angeregt, genauer Valenzelektronen. Die Elektronenübergänge, die dabei auftreten können, lassen sich mit Hilfe der beteiligten Molekülorbitale bestimmen. Nach dem MO-Schema spalten sich die Orbitale bei Überlappung in besetzte bindende (σ, π) und nicht bindende Orbitale (n), sowie in nichtbesetzte antibindende Orbitale (π*, σ*) auf. In der Regel befinden sich alle Elektronen im bindenden Orbital und das antibindende Orbital bleibt leer. Werden Elektronen angeregt, wechseln sie in das antibindende Orbital. Man unterscheidet daher folgende Elektronenübergänge, die mit σ→σ*, π→π*, n→π* usw. bezeichnet werden. σ-Orbitale liefern eine wesentlich größere Aufspaltung als π-Orbitale, da die Energieaufspaltung zwischen dem bindenden und dem antibindenden Orbital mit dem Grad der Überlappung der Atomorbitale zunimmt.mini|Schematische Darstellung von Molekülorbitalen und ElektronenübergängenDie für die Absorption verantwortlichen Molekülbestandteile werden als Chromophore (griechisch: farbtragend) bezeichnet.mini|Absorptionsbereiche verschiedener Elektronenübergänge Elektronenabsorption organischer Verbindungen Organische Verbindungen, insbesondere solche mit hohem Konjugationsgrad, absorbieren auch Licht im UV- oder sichtbaren Bereich des elektromagnetischen Spektrums.