Auflösung (Mikroskopie)

mini|Rayleigh-Kriterium: zwei Beugungsscheibchen, die sich gerade noch unterscheiden lassen

Unter optischer oder räumlicher Auflösung versteht man in der Mikroskopie den Abstand, den zwei Strukturen mindestens haben müssen, um nach der optischen Abbildung noch als getrennte Bild-Strukturen wahrgenommen zu werden. Dabei wird beispielsweise der zur getrennten Erkennung nötige minimale Abstand zweier punktförmiger Objekte oder der minimale Abstand zwischen Linien in einem optischen Gitter betrachtet.

Die erreichbare Auflösung ist in der klassischen Lichtmikroskopie fundamental dadurch begrenzt, dass die das Objekt umgebenden optischen Nahfelder nicht durch das optische System übertragen werden, was manchmal auch als Beugung am freien Raum bezeichnet wird. Dieser minimale Objektabstand wird als Auflösungsgrenze oder Abbe-Limit bezeichnet. Ernst Abbe hat diese Beziehung im 19. Jahrhundert beschrieben. Neuere methodische Ansätze erlauben eine Auflösung deutlich jenseits dieser Grenze, sie werden zusammenfassend als () bezeichnet. Derartige Techniken sind beispielsweise RESOLFT-Mikroskopie mit STED-Mikroskopie, Mikroskopie mit modulierter Beleuchtung (SIM), Photoactivated Localization Microscopy (STORM-Mikroskopie) und optisches Rasternahfeldmikroskop.

Es gibt verschiedene Ansätze, die erzielbare Auflösung zu bestimmen. Abbe ging von einem Gitter mit eng beieinander liegenden Linien aus, die von Licht durchstrahlt werden, und berechnete, wie dicht die Linien sein dürfen, so dass sie gerade noch als Linien aufgelöst werden können. Abbe untersuchte beleuchtete (passive) Objekte. John William Strutt, 3. Baron Rayleigh betrachtete punktförmige Lichtquellen. Er beschrieb den Abstand aktiver Objekte, die gerade noch als getrennt zu erkennen waren.Hermann Strass: Das Abbe-Limit überwinden. In: GIT Labor-Fachzeitschrift. Januar 2016, S. 11. Diesem Ansatz verwandt ist die Bestimmung der Halbwertsbreite des mikroskopischen Signals einer punktförmigen Lichtquelle. Alle drei Ansätze führen rechnerisch zu sehr ähnlichen Werten für die Auflösung.Christoph Cremer: Lichtmikroskopie unterhalb des Abbe-Limits. Lokalisationsmikroskopie. In: Physik in unserer Zeit. 42, Nr. 1, 2011, S. 21–29, doi:10.1002/piuz.201101251.

Um die theoretisch mögliche Auflösung zu ermöglichen, ist es erforderlich, dass genügend Licht gesammelt wird. Bei Hellfeldmikroskopie ist dies in der Regel unproblematisch. Bei der Fluoreszenzmikroskopie können niedrige Intensitäten in Verbindung mit kurzen Belichtungszeiten dazu führen, dass zu wenige Photonen am Detektor auftreffen und der erreichte Kontrast zur getrennten Erkennung der Strukturen nicht ausreicht.

Von der Auflösung zu unterscheiden ist die Nachweisbarkeit und die erreichbare Positionierungsgenauigkeit. Mit Dunkelfeldmikroskopie, besonders der Ultramikroskopie, oder der Fluoreszenzmikroskopie lassen sich noch Partikel nachweisen, deren Größe erheblich unter der Auflösungsgrenze liegt, bei Fluoreszenzmikroskopie bis hinunter zu einzelnen Farbstoffmolekülen. Bei der Positionierungsgenauigkeit geht es darum, die Position einer Oberfläche oder eines Körpers möglichst genau im Raum zu bestimmen. Dazu kann das Helligkeitsmaximum des von einem Körper ausgehenden Lichts bestimmt werden. Dies ist mit einer Genauigkeit im Nanometerbereich möglich. In beiden Fällen unterschreitet die Auflösung jedoch nicht die Auflösungsgrenze: Es ist beispielsweise nicht möglich festzustellen, ob ausgesandtes Licht tatsächlich von einer punktartigen Struktur stammt oder von mehreren nahe beieinander liegenden.

Abbe-Limit Herleitung und Anwendungsbereich mini|Mikroskopische Aufnahme eines Gitters mit 600 Linien pro Millimeter, das für Beugungsversuche verwendet werden kann. mini|Beugung eines Laserstrahls (von links kommend) an einem Strichgitter. Es handelt sich um ein Beispiel einer zentralen Beleuchtung, da das Gitter nicht (auch) von schräg einfallendem Licht beleuchtet wird. Ein Objektiv könnte vom Gitter nur dann ein Bild mit Strukturinformation erzeugen, wenn außer dem Hauptmaximum (gerade Fortsetzung des Laserstrahls) noch mindestens das erste Nebenmaximum (Strahlen im 20°-Winkel) aufgefangen wird. mini|Der halbe Öffnungswinkel α eines Objektivs. Hier beträgt der Wert etwa α = 50°. Für ein Trockenobjektiv ergibt das eine numerische Apertur von sin 50° = 0,77.

Ernst Abbe untersuchte das Beugungsverhalten des Lichts an Strichgittern. Je dichter die Striche des (optischen) Gitters beieinander liegen (also je mehr Linien auf einen Millimeter kommen), desto stärker wird hindurch tretendes Licht gebeugt. Es wird zunächst der Fall betrachtet, dass das Licht (nur) senkrecht auf die Rückseite des Gitters auftrifft (zentrale Beleuchtung). Um Informationen über die abzubildende Gitterstruktur zu erhalten, muss außer dem gerade (senkrecht) durch das Gitter hindurch tretenden Hauptmaximum des Beugungsmusters auch mindestens das erste Nebenmaximum aufgefangen werden. Die Öffnung (genauer: der Öffnungswinkel) des Objektivs muss hierfür ausreichend groß sein. Liegen die Striche des Gitters so dicht beieinander, dass das erste Nebenmaximum nicht mehr vom Objektiv aufgefangen werden kann, wird die Gitterstruktur demnach nicht mehr aufgelöst.

Abbe schrieb über diese Zusammenhänge 1873 in seinem Werk „Beiträge zur Theorie des Mikroskops und der mikroskopischen Wahrnehmung“:

und an anderer Stelle genauer:

„Schiefe Beleuchtung“ meint hier eine Beleuchtung mit Kondensor, der bewirkt, dass das Licht als Strahlkegel auf das Präparat auftrifft und nicht als Zylinder wie bei zentraler Beleuchtung. Eine korrekte Beleuchtung, die auch schräg einfallendes Licht einschließt, ist zum Erreichen der maximal möglichen Auflösung wesentlich. Außerdem zeigt sich die Bedeutung der Wellenlänge: Da kurzwelliges (blaues) Licht weniger stark gebeugt wird als langwelliges (rotes), kann mit kurzwelligem Licht eine bessere Auflösung erreicht werden. Das Abbe-Kriterium ist absolut, es kann mit klassischer Mikroskopie nicht überwunden werden.

Die abbeschen Überlegungen zur Bildentstehung gelten für Fälle, in denen einfallendes Licht vom Präparat gebeugt wird und dann weiter zum Detektor geleitet wird. Da die Beleuchtung von einer Lichtquelle kommt, kann sie als kohärent angesehen werden. Für selbstleuchtende Objekte machen Abbes Überlegungen keine Aussagen. Auch für die Auflösung entlang der optischen Achse (z-Richtung) wird keine Angabe gemacht.

Formeln Für alle Formeln gilt: ist die erzielbare Auflösung, genauer: der Abstand, den zwei Linien in einem Gitter mindestens haben müssen, damit sie im Mikroskop noch als getrennte Linien erkannt werden können.

Zentrale Beleuchtung Für den Fall einer ausschließlich zentralen Beleuchtung ohne Kondensor ergibt sich

oder, da die numerische Apertur (NA) ist, .

mit λ der Wellenlänge des verwendeten Lichts, n dem Brechungsindex des Immersionsmediums und α dem halben Öffnungswinkel des Objektivs in Radiant (Einheit).

Objektiv mit kleinerer NA als Kondensor mini|Abbe-Denkmal in Jena mit der Auflösungsformel im oberen Bereich. Die von Abbe erwähnte „äußerste schiefe Beleuchtung“ bezeichnet einen Durchlicht-Strahlengang, bei dem zur Beleuchtung ein Kondensor eingesetzt wird, der mindestens den gleichen Öffnungswinkel beziehungsweise mindestens die gleiche numerische Apertur hat wie das Objektiv. Für diesen Fall ergibt sich die Abbe’sche Formel in ihrer wohl bekanntesten Form:

oder, wegen verkürzt

Objektiv mit größerer oder gleich großer NA wie Kondensor Wenn die numerische Apertur von Kondensor und Objektiv gleich groß sind ergibt sich ein praktisches Problem: Der Bildkontrast ist sehr niedrig. Ein optimaler Bildkontrast stellt sich ein, wenn die numerische Apertur des Kondensors bei 2/3 der numerischen Apertur des Objektivs liegt. Gegebenenfalls kann die Kondensorblende (= Aperturblende) zugezogen werden, um dies zu erreichen. Unter der Bedingung, dass die Kondensorapertur kleiner ist als die Objektivapertur gilt folgende Formel:

Diese Fassung kann auch als allgemeine Form angesehen werden, da bei zentraler Beleuchtung gilt und sich bei gleich großen Aperturen wiederum 2NA unter dem Bruchstrich ergibt.

Beispiele Objektiv mit NA 0,25 (bei vielen 10x-Objektiven); Kondensor mit NA 0,55, gelb-grünes Licht mit 550 nm, da das Auge für diesen Farbbereich am empfindlichsten ist.

Die Kondensorapertur kann maximal mit dem gleichen Wert eingehen wie die Objektivapertur, daher wird im Fall einer größeren Kondensorapertur die Objektivapertur mal zwei genommen. Objektiv mit NA 0,65 (bei vielen 40x-Objektiven); Kondensor mit 0,55, Licht mit 550 nm.

Ölimmersionsobjektiv mit NA 1,4 und Ölimmersionskondensor mit 1,4, Licht mit 550 nm

Rayleigh-Kriterium

mini|Helligkeitsverteilung bei zwei nah beieinander liegenden leuchtenden Punkten. A: Der Abstand entspricht etwa der Halbwertsbreite, die Punkte können nicht aufgelöst werden. B: Sparrow Limit, ein nachweisbarer Helligkeitsabfall zwischen den Maxima. C: Rayleigh-Kriterium, das Maximum eines Punktes liegt im ersten Minimum des anderen. D: Die Punkte sind deutlich voneinander getrennt. mini|links|Beugungsscheibchen. Um das helle Zentrum liegen Ringe, die zunehmend schwächer werden.

Herleitung und Anwendungsbereich Für die Auflösung selbstleuchtender Strukturen, wie sie unter anderem in der Fluoreszenzmikroskopie auftreten, gelten die hier aufgeführten Gesetzmäßigkeiten. Die Erstbeschreibung dieser Regeln für die Mikroskopie wird je nach Lehrbuch entweder auf eine Arbeit von 1896 von John William Strutt, 3. Baron Rayleigh, zurückgeführt, oder auf Rayleigh und Hermann von Helmholtz oder nur auf Arbeiten von Helmholtz von 1873 oder 1874. In allen Fällen wird das entsprechende Kriterium als Rayleigh-Kriterium bezeichnet, das aus der Astronomie bzw. vom Teleskop auf das Mikroskop übertragen wurde.

Mikroskopische Bilder selbstleuchtender Punkte sind keine Punkte, sondern Beugungsmuster, deren Helligkeitsverteilung von der Punktspreizfunktion abhängt. Diejenige Ebene des Musters, welche die höchste Intensität enthält (Schärfeebene), wird als Beugungsscheibchen bezeichnet. Das Rayleigh-Kriterium besagt, dass sich zwei selbstleuchtende Punkte, die nebeneinander in der Schärfeebene liegen, dann gerade noch unterscheiden lassen, wenn das Intensitätsmaximum des Beugungsscheibchens des ersten Punktes in das Minimum des Beugungsscheibchens des zweiten Punktes fällt (siehe Abbildung). Die Helligkeit der dunkelsten Stelle zwischen den beiden Maxima beträgt dann 73,5 % der Maxima. Beim Rayleigh-Kriterium handelt es sich also um eine Konvention und nicht um ein absolutes Kriterium, da manche Beobachter vielleicht auch noch Beugungsscheibchen unterscheiden können, die noch dichter zusammen liegen.

Formel Die in diesem Abschnitt aufgeführten Formeln gelten für selbstleuchtende Punkte bei Beobachtung mit klassischer Mikroskopie, beispielsweise in der klassischen Fluoreszenzmikroskopie. Für konfokale Mikroskopie und Multiphotonen-Anregung siehe die entsprechenden Abschnitte.

Auch beim Rayleigh-Kriterium geht die Wellenlänge ein, jedoch nicht wie beim Abbe-Limit die von am Objekt gebeugten Licht, sondern die Wellenlänge des vom Objekt abgestrahlten Lichts, bei Fluoreszenzmikroskopie also die Wellenlänge der Fluoreszenz.

Die Auflösung (Rayleigh-Kriterium) in der Fokusebene beträgt  ,   manchmal auch angegeben in der Form   , wobei NA die numerische Apertur des verwendeten Objektivs ist und λ die Wellenlänge des emittierten Lichtes.

Axiale Auflösung