DNA-Sequenzierung ist die Bestimmung der Nukleotid-Abfolge in einem DNA-Molekül. Die DNA-Sequenzierung hat die biologischen Wissenschaften revolutioniert und die Ära der Genomik eingeleitet. Seit 1995 konnte durch DNA-Sequenzierung das Genom von über 50.000 (Stand: 2020) verschiedenen Organismen analysiert werden. Zusammen mit anderen DNA-analytischen Verfahren wird die DNA-Sequenzierung u. a. auch zur Untersuchung genetisch bedingter Erkrankungen herangezogen. Darüber hinaus ist die DNA-Sequenzierung als analytische Schlüsselmethode, insbesondere im Rahmen von DNA-Klonierungen (engl. molecular cloning), aus einem molekularbiologischen bzw. gentechnischen Laborbetrieb heute nicht mehr wegzudenken.
Problemstellung Die DNA-Sequenzierung als Ablesen der Nukleotidfolge von DNA war über Jahrzehnte hinweg bis in die Mitte der 1970er Jahre ein ungelöstes Problem, bis entsprechende biochemische bzw. biotechnologische Methoden entwickelt wurden. Heutzutage ist selbst die Sequenzierung ganzer Genome vergleichsweise schnell und einfach geworden.
Die Herausforderungen einer Genomsequenzierung beschränken sich jedoch nicht nur auf das direkte Ablesen der Nukleotidsequenz. Je nach Verfahren werden in jeder einzelnen Sequenzierreaktion auf Grund technischer Beschränkungen nur kurze DNA-Abschnitte (engl. reads) bis maximal 1000 Basenpaare abgelesen. Nach Erhalt der Sequenz wird dann der nächste Primer (mit einer Sequenz aus dem Ende der vorigen Sequenzierung) hergestellt, was als oder bei ganzen Chromosomen als bezeichnet wird und 1979 erstmals angewendet wurde.A. C. Chinault, J. Carbon: Overlap hybridization screening: isolation and characterization of overlapping DNA fragments surrounding the leu2 gene on yeast chromosome III. In: Gene. Band 5(2), 1979, S. 111–126. PMID 376402.
Ein größeres Sequenzierprojekt, wie das Humangenomprojekt, bei dem mehrere Milliarden Basenpaare sequenziert wurden, erfordert darum eine Herangehensweise, die als Shotgun Sequencing bezeichnet wird. Dabei werden längere DNA-Abschnitte zunächst in kleinere Einheiten zerlegt, diese dann sequenziert und die Sequenzinformationen der einzelnen kurzen Abschnitte anschließend mit bioinformatischen Methoden wieder zu einer vollständigen Gesamtsequenz zusammengefügt. Um aus den rohen Sequenzdaten biologisch relevante Informationen zu gewinnen (beispielsweise Informationen über vorhandene Gene und deren Kontrollelemente), schließt sich an die Sequenzierung die DNA-Sequenzanalyse an. Ohne sie bleibt jede Sequenzinformation ohne wissenschaftlichen Wert.
Sequenzierungsmethoden mini|DNA-Sequenzierungsgeräte (2005) Es gibt heute mehrere Verfahren zum Ablesen der Sequenzinformation von einem DNA-Molekül. Lange Zeit waren überwiegend Weiterentwicklungen der Methode nach Frederick Sanger in Verwendung. Moderne Verfahren bieten Möglichkeiten der beschleunigten Sequenzierung durch hochparallelen Einsatz. Die nach der Sanger-Methode entwickelten Sequenzierungsverfahren werden häufig als Sequenzierung der nächsten Generation (engl. next generation sequencing, NGS) bezeichnet. Die Sequenzierung der dritten Generation wird nach dem Englishen Third Generation Sequencing auch als TGS bezeichnet.
Klassische Methoden Methode von Maxam und Gilbert Die Methode von Allan Maxam und Walter Gilbert von 1977 beruht auf der basenspezifischen chemischen Spaltung der DNA durch geeignete Reagenzien und anschließender Auftrennung der Fragmente durch denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese.A. Maxam, W. Gilbert: A new method of sequencing DNA. In: Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. Band 74, 1977, S. 560–564. PMID 265521; . Die DNA wird zunächst an einem 5' oder 3'-Ende mit radioaktivem Phosphat oder einem nicht-radioaktiven Stoff (Biotin, Fluorescein) markiert. In vier getrennten Ansätzen werden dann jeweils bestimmte Basen vom Zucker-Phosphat-Rückgrat der DNA partiell (limitiert) modifiziert und abgespalten, beispielsweise wird die Base Guanin (G) durch das Reagenz Dimethylsulfat methyliert und durch Alkalibehandlung mit Piperidin entfernt. Danach wird der DNA-Strang komplett gespalten. In jedem Ansatz entstehen Fragmente unterschiedlicher Länge, deren 3'-Ende stets an bestimmten Basen gespalten worden war. Die denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese trennt die Fragmente nach der Länge auf, wobei Längenunterschiede von einer Base aufgelöst werden. Durch Vergleich der vier Ansätze auf dem Gel lässt sich die Sequenz der DNA ablesen. Ihren Erfindern ermöglichte diese Methode die Bestimmung der Operon-Sequenz eines Bakteriengenoms. Die Methode kommt heute kaum noch zum Einsatz, da sie gefährliche Reagenzien benötigt und schwerer automatisierbar ist als die zur gleichen Zeit entwickelte Didesoxymethode nach Sanger.
Didesoxymethode nach Sanger Die Didesoxymethode nach Sanger wird auch Kettenabbruch-Synthese genannt. Sie stellt eine enzymatische Methode dar. Sie wurde von Sanger und Coulson um 1975 entwickelt und bereits 1977 mit der ersten vollständigen Sequenzierung eines Genoms (Bakteriophage φX174)F. Sanger et al.: Nucleotide sequence of bacteriophage phi X174 DNA. In: Nature. Band 265, 1977, S. 687–695. doi:10.1038/265687a0;PMID 870828. vorgestellt.F. Sanger et al.: DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. In: Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. Band 74, 1977, S. 5463–5467. PMID 271968; . Sanger erhielt für seine Arbeiten zur DNA-Sequenzierung zusammen mit Walter Gilbert und Paul Berg 1980 den Nobelpreis für Chemie.
mini|360px|Prinzip der DNA-Sequenzierung nach der Didesoxy-Methode. dNTP ist die allgemeine Abkürzung für ein Nukleosidtriphosphat und kann für dATP, dCTP, dGTP oder dTTP stehen. ddNTPs sind die entsprechenden Didesoxy-Varianten der dNTPs. Der Einbau eines ddNTPs führt zum Abbruch der Polymerisationsreaktion. Die blauen Punkte am 5'-Ende des Primers stellen eine Markierung dar (z. B. eine fluoreszierende Gruppe), mittels der die Syntheseprodukte später im Gel sichtbar gemacht werden können. Alternativ lassen sich auch radioaktiv markierte Nukleosidtriphosphate zur Polymerisationsreaktion einsetzen.
Ausgehend von einem kurzen Abschnitt bekannter Sequenz (Primer) wird durch eine DNA-Polymerase einer der beiden komplementären DNA-Stränge verlängert. Zunächst wird die DNA-Doppelhelix durch Erwärmung denaturiert, woraufhin Einzelstränge für das weitere Vorgehen zur Verfügung stehen. In vier sonst gleichen Ansätzen (alle beinhalten die vier Nukleotide, von denen eines radioaktiv markiert istF. Sanger, A. R. Coulson: A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. In: Journal of Molecular Biology. Band 93, 1975, S. 441–448. PMID 1100841.) wird je eine der vier Basen zum Teil als Didesoxynukleosidtriphosphat (ddNTP) zugegeben (also je ein Ansatz mit entweder ddATP, ddCTP, ddGTP oder ddTTP). Diese Kettenabbruch-ddNTPs besitzen keine 3'-Hydroxygruppe: Werden sie in den neusynthetisierten Strang eingebaut, ist eine Verlängerung der DNA durch die DNA-Polymerase nicht mehr möglich, da die OH-Gruppe am 3'-C-Atom für die Verknüpfung mit der Phosphatgruppe des nächsten Nukleotids fehlt. In der Folge entstehen DNA-Fragmente unterschiedlicher Länge, die in jedem einzelnen Ansatz stets mit dem gleichen ddNTP enden (also je Ansatz nur mit A oder C oder G oder T). Nach der Sequenzier-Reaktion werden die markierten Abbruchprodukte aus allen Ansätzen mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese der Länge nach aufgetrennt. Durch Vergleich der vier Ansätze kann man die Sequenz nach der Exposition des radioaktiven Gels auf einem fotografischen Film (Röntgenfilm) ablesen. Die dementsprechend komplementäre Sequenz ist die Sequenz der verwendeten einsträngigen DNA-Matrize. Als Sequenzier-Reaktion kommt heutzutage eine Variation der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zum Einsatz. Anders als bei der PCR wird nur ein Primer eingesetzt, sodass die DNA nur linear amplifiziert wird.
Ein radioaktives Verfahren zur DNA-Sequenzierung, durch den Transfer der DNA Moleküle auf einen Träger während der elektrophoretischen Auftrennung, wurde von Fritz M. Pohl und seiner Arbeitsgruppe Anfang der 1980er Jahre entwickelt.S. Beck, F. M. Pohl: DNA sequencing with direct blotting electrophoresis. In: The EMBO journal. Band 3, Nummer 12, Dezember 1984, S. 2905–2909. PMID 6396083. . Die Vermarktung des „Direct-Blotting-Electrophoresis System GATC 1500“, erfolgte durch das Konstanzer Unternehmen GATC Biotech. Der DNA-Sequenzierer wurde z. B. im Rahmen des europäischen Genomprojekts zur Sequenzierung des Chromosoms II der Hefe Saccharomyces cerevisiae eingesetzt.H. Feldmann, M. Aigle et al.: Complete DNA sequence of yeast chromosome II. In: The EMBO journal. Band 13, Nummer 24, Dezember 1994, S. 5795–5809, PMID 7813418. .
Seit Anfang der 1990er Jahre werden vor allem mit Fluoreszenz-Farbstoffen markierte Didesoxynukleosidtriphosphate eingesetzt. Jedes der vier ddNTPs wird mit einem unterschiedlichen Farbstoff gekoppelt. Diese Modifikation erlaubt es, alle vier ddNTPs in einem Reaktionsgefäß zuzugeben, eine Aufspaltung in getrennte Ansätze und der Umgang mit Radioisotopen entfällt. Die entstehenden Kettenabbruchprodukte werden mittels Kapillarelektrophorese aufgetrennt und mit Hilfe eines Lasers zur Fluoreszenz angeregt. Die ddNTPs am Ende jedes DNA-Fragmentes zeigen dadurch Fluoreszenz unterschiedlicher Farbe und können so von einem Detektor erkannt werden. Das Elektropherogramm (die Abfolge der Farbsignale, die am Detektor erscheinen) gibt direkt die Sequenz der Basen des sequenzierten DNA-Stranges wieder.
Moderne Ansätze Mit der zunehmenden Bedeutung der DNA-Sequenzierung in der Forschung und Diagnostik wurden Methoden entwickelt, die einen erhöhten Durchsatz erlauben. Damit ist es nun möglich, das komplette menschliche Genom in etwa 8 Tagen zu sequenzieren. Die entsprechenden Verfahren werden als Sequenzierung der zweiten Generation (engl. second generation sequencing) bezeichnet. Verschiedene Firmen haben Verfahren mit unterschiedlichen Vor- und Nachteilen entwickelt. Außer den hier aufgeführten gibt es noch weitere. Die DNA-Sequenzierung der zweiten Generation wurde von der Zeitschrift Nature Methods zur Methode des Jahres 2007 gekürt.Anonym: Method of the Year. In: Nature Methods. 5, 2008, S. 1, doi:10.1038/nmeth1153. Im Gegensatz zur DNA-Sequenzierung nach Sanger werden in einem Reaktionsgefäß parallel mehrere Sequenzen bestimmt, allerdings nur von kurzen Fragmenten. Diese werden aufgrund von Sequenzüberlappungen durch eine Software (in silico) zusammengefügt. Dadurch können beispielsweise in der Onkologie Mutationen in einer Mischung mit unmutierten Sequenzen mit einer Sensitivität von unter 1 % nachgewiesen werden, während die Sensitivität für Mutationen bei der Sanger-Methode bei etwa 10 % liegt. Je öfter die Fragmente sequenziert werden (d. h. je besser die Coverage), desto besser wird die Sensitivität.
Pyrosequenzierung mini|Rohdaten (mittig) samt DNA-Sequenz (rechts) dargestellt in OpenChrom