mini|400px|Übersicht über die Prozesse der eukaryotischen Genexpression: Auf dem Weg vom Gen – codiert auf der DNA – bis hin zum fertigen Protein spielt die RNA eine entscheidende Rolle. Sie dient als Informationsträger zwischen DNA und Ribosom, der in mehreren Schritten verändert wird mini|400px|Schematische Darstellung des Splicing. mini|400px|Schematische Darstellung für alternatives Splicing. Als Spleißen bzw. Splicing ( ‚miteinander verbinden‘, ‚zusammenkleben‘) wird ein wichtiger Schritt der Weiterverarbeitung (Prozessierung) der Ribonukleinsäure (RNA) bezeichnet, der im Zellkern von Eukaryoten stattfindet und bei dem aus der prä-mRNA die reife mRNA entsteht.
Die zunächst in der Transkription gebildete prä-mRNA enthält noch Introns und Exons. Durch das Splicing werden die Introns entfernt und die angrenzenden Exons miteinander zur fertigen mRNA verknüpft.
Beim Capping des 5'-Endes, sowie Splicing und Polyadenylierung (Tailing) des 3'-Endes handelt es sich um einen cotranskriptionalen Vorgang.
Geschichte der Entdeckung Frühe genetische Untersuchungen konnten zeigen, dass Gen, mRNA und Protein colinear sind, was durch die direkte Abschrift bzw. Übersetzung naheliegend war. Sehr gut ist dies in prokaryotischen Organismen zu beobachten, wo Transkription und Translation nicht durch eine Kompartimentierung der Zelle voneinander getrennt sind. Noch während die RNA-Polymerase die mRNA an der DNA synthetisiert, können bereits Ribosomen die naszierende Kette binden und mit der Translation beginnen, wodurch es zur Ausbildung sogenannter Polysomen kommt.
In Eukaryoten ist eine Kopplung von Transkription und Translation aber nicht möglich, da eine Kernmembran die beiden Prozesse räumlich voneinander trennt.
Darüber hinaus konnten Chow et al.Louise T.Chow, James M.Roberts, James B.Lewis, Thomas R.Broker (1977): "An amazing sequence arrangement at the 5' ends of adenovirus 2 messenger RNA". Cell. 12 (1), 1–8. doi:10.1016/0092-8674(77)90180-5 und Berget et al.Susan M. Berget, Claire Moore, Phillip A. Sharp (1977): "Spliced segments at the 5' terminus of adenovirus 2 late mRNA". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (8), 3171–3175. doi:10.1073/pnas.74.8.3171 in sehr anschaulichen elektronenmikroskopischen Untersuchungen von RNA:DNA-Hybriden am Beispiel von Adenoviren zeigen, dass die mRNA in Eukaryoten offenbar einer zusätzlichen Prozessierung unterliegen muss, da ihr interne Bereiche fehlen, die aber in der DNA vorkommen. Indirekt konnte eine Reifung anhand der im Vergleich zu zytoplasmatischen RNAs kurzen Halbwertszeit von primären Transkripten, den sogenannten heterogenen nukleären RNAs (hnRNAs) gezeigt werden.
Richard John Roberts und Phillip A. Sharp entwickelten auf dieser Basis das Konzept der split genes und des prä-mRNA-Spleißens, das 1993 mit dem Nobelpreis für Medizin belohnt wurde.„Nobelpreis in Medizin, 1993“ Offizielle Website des Nobelpreiskomitees. Abgerufen am 28. Mai 2021. Grundlegend neu dabei war, dass der Bereich eines eukaryotischen Gens auf der DNA immer wieder von Sequenzen unterbrochen wird, die nicht in Aminosäuren des späteren Proteins translatiert werden. Diese sogenannten intervening sequences, auch als Introns bezeichnet, werden in einem als prä-mRNA-Spleißen bezeichneten Prozess aus dem Primärtranskript, der prä-mRNA (precursor-mRNA), ausgeschnitten und degradiert. Dabei werden gleichzeitig die beiden angrenzenden proteincodierenden Sequenzabschnitte, oder kurz Exons für expressed sequences, miteinander verknüpft.
Ein Gen kann dabei bis zu über 60 Introns mit Längen zwischen 35 und 100.000 Nukleotiden enthalten. Darüber hinaus tritt das Splicing nicht nur bei den genannten Eukaryoten auf, sondern auch in Mitochondrien, Archaea und einigen der bereits erwähnten viralen RNAs.
Autokatalytisches Spleißen (self-splicing) Einige RNAs können Introns ohne die Hilfe eines großen Spliceosoms (siehe unten) entfernen. Die chemische Aktivität dazu besitzen sie selbst, d. h., es handelt sich um Ribozyme, die nur in einigen Fällen (Gruppe II Introns) die Hilfe von Proteinen für eine korrekte Faltung benötigen.
1981 konnten T. Cech et al. für den Vorläufer der 26S rRNA von Tetrahymena thermophila nachweisen, dass für die Prozessierung eines etwa 400 Nukleotide langen Introns keine Proteinkomponenten benötigt werden, sondern dass die Aktivität von der RNA selber herrührt. Man spricht daher auch vom autokatalytischen Splicing oder self-splicing. Für diese Entdeckung eines ersten Ribozyms und damit der katalytischen Aktivität von RNA, was zur Postulierung einer RNA-Welt in der sehr frühen Phase der Entstehung des Lebens führte, wurde Thomas R. Cech zusammen mit Sidney Altman 1989 mit dem Nobelpreis für Chemie ausgezeichnet.„Nobelpreis in Chemie, 1989“ Offizielle Website des Nobelpreiskomitees. Abgerufen am 18. Juni 2010. Spätere Untersuchungen konnten zeigen, dass Self-splicing-Introns in vielen weiteren Organismen auftreten. Entsprechend der Reaktionsmechanismen und der konservierten Sequenzelemente der RNAs können zwei Arten des self-splicings unterschieden werden, die sogenannten Gruppe-I und Gruppe-II-Introns. Auch wenn schlüssig gezeigt werden konnte, dass die RNA die katalytische Aktivität besitzt, scheinen in vivo an den Reaktionen beider Gruppen von Introns zusätzlich Proteine beteiligt zu sein, die wahrscheinlich das Ausbilden der aktiven Struktur der RNA fördern. Da bei den im Folgenden geschilderten Reaktionen die Gesamtzahl der Phosphodiesterbindungen stets gleich bleibt, weil es sich um Umesterungen handelt, sind keine energieliefernden Cofaktoren notwendig.
Gruppe-I-Introns treten in der prä-rRNA einfacher Eukaryoten, wie z. B. dem bereits erwähnten Ciliaten T. thermophila, sowie in einigen prä-mRNAs von Zellorganellen wie Mitochondrien und Chloroplasten auf. Die Exzision des Introns findet in einem Zweischrittmechanismus statt, wobei ein als Cofaktor für die Reaktion essentielles Guanosin, das durch die Struktur der RNA in die geeignete Position gebracht wird, zunächst einen nucleophilen Angriff auf die 5’-splice-site durchführt. Die nucleofuge Gruppe dieser Reaktion, die 3’-Hydroxygruppe des 5’ gelegenen Exons, greift nun seinerseits als Nucleophil die 3’-splice-site an, wodurch die beiden Exons unter Freisetzung des Introns miteinander verknüpft werden. In darauf folgenden Reaktionen schließt sich das Intron schließlich zu einem Ring. Stereochemische Untersuchungen an chiralen Substraten lassen vermuten, dass hier ein einziges katalytisches Zentrum beide Teilreaktionen des Splicings in Form einer Hin- und Rückreaktion katalysiert.
Gruppe-II-Introns finden sich dagegen in prä-mRNAs der Mitochondrien von Hefen und anderen Pilzen und in manchen RNA-Vorläufern der Chloroplasten mancher einzelliger Eukaryoten wie Chlamydomonas. Ein Guanosin-Cofaktor ist hier nicht notwendig, vielmehr wird durch die Struktur der RNA ein 7 oder 8 Nukleotide upstream der 3’ splice-site gelegenes Adenosin in die Lage versetzt die 5’ splice-site nucleophil mit seiner 2’ Hydroxy-Gruppe angreifen zu können. Dies führt zur Knüpfung einer ungewöhnlichen 2’ 5’ Phosphodiesterbindung und damit zur Ausbildung einer lassoartigen Struktur des Introns, dem sogenannten Lariat. In einer zweiten Reaktion, ähnlich der der Gruppe-I-Introns, greift schließlich die 5’-splice-site die 3’ splice-site nucleophil an, was zur Verknüpfung beider Exons und dem Freisetzen des Introns führt.
Beim spliceosomalen Prozessieren von mRNAs (siehe unten) findet sich ein dem der Gruppe-II-Introns identischer Reaktionsmechanismus, was zu einer Reihe von Spekulationen geführt hat, ob beide Prozesse evolutionär auseinander hervorgegangen sind (siehe unten bei der „Intron-early“-Hypothese), beispielsweise durch Fragmentierung eines Gruppe-II-Introns, oder ob es sich um konvergente Entwicklungen bedingt durch die katalytische Optimierung der gleichen chemischen Reaktion handelt.
Analog zum Spleißen von RNA ist das Proteinspleißen definiert.
Splicen von tRNAs Das enzymatische Splicing von tRNAs findet sich sowohl bei Archaea als auch bei Eukaryoten, in Bakterien dagegen werden Introns in tRNAs nach einem autokatalytischen Mechanismus prozessiert, der im vorangegangenen Abschnitt beschrieben wurde. Die Introns in den für die tRNAs codierenden Genen finden sich meist in der Anticodonschleife direkt 3’ des Anticodons – seltener in der Dihydrouracilschleife – und besitzen eine Länge von 14 bis 60 Basen. Beim enzymatischen Splicing werden sie im Gegensatz zum Splicing von prä-mRNAs nicht über ihre Sequenz, sondern über eine übergeordnete Struktur des Gesamtmoleküls erkannt (beispielsweise das bulge-helix-bulge-motif – BHB-motif – bei Archaea) und in drei Schritten entfernt. Dabei wird die prä-tRNA zunächst zweimal durch eine Endonuklease geschnitten, die das Intron und zwei sogenannte tRNA-Halbmoleküle freisetzt. Das dabei entstehende zyklische 2’ 3’ Phosphat des 5’ Halbmoleküls wird anschließend zu einem 2’ Phosphat und einer 3’ OH-Gruppe hydrolysiert, während die 5’ OH Gruppe des 3’ Halbmoleküls unter GTP-Verbrauch phosphoryliert wird. Dies ermöglicht eine Ligation durch eine RNA-Ligase unter ATP-Hydrolyse. Schließlich wird im letzten Schritt das 2’ Phosphat entfernt, was ungewöhnlicherweise unter NAD-Verbrauch und Freisetzung von Nicotinamid vonstattengeht. Auch einige mRNAs werden nach einem ähnlichen, für sie eigentlich sehr untypischen Mechanismus aus zwei endonukleolytischen Spaltungen mit anschließender Ligation durch eine tRNA-Ligase prozessiert.
Splicing im Spliceosom Das Splicen findet in den meisten Fällen in einem großen Komplex aus RNA und Proteinen statt, dem sogenannten Spliceosom, welches die Reaktion in zwei aufeinanderfolgenden Umesterungen katalysiert. Die Mehrzahl der Introns wird auf diese Art und Weise entfernt. Die Anzahl der Bindungen bleibt bei der Reaktion insgesamt gleich, Energie wird nur für den Aufbau und die Umlagerung der Maschinerie für die Katalyse (Spliceosom) benötigt. Die beiden Einzelreaktionen unterscheiden sich chemisch nicht voneinander, lediglich die Positionen der beteiligten Gruppen in der prä-mRNA sind unterschiedlich. Bei beiden Reaktionen findet eine nukleophile Substitution (SN2) an einem Phosphat statt, das Nukleophil ist jeweils eine Hydroxygruppe einer Ribose.
Im ersten Schritt greift das Sauerstoffatom der 2'-OH-Gruppe eines Adenosins aus der sogenannten „branch point sequence“ (BPS) ein Phosphoratom einer Phosphodiesterbindung in der 5'-splice site an. Dies führt zur Freisetzung des 5'-Exons und zur Zirkularisierung des Introns (aufgrund der lassoartigen Struktur „Lariat“ genannt). Im zweiten Schritt greift nun der Sauerstoff der frei gewordenen 3'-OH-Gruppe des 5'-Exons die 3'-splice site an, was zur Verknüpfung der beiden Exons und zur Freisetzung des Intron-Lariats führt.
Das Splicing-Muster kann sich aufgrund der Gewebeart und unter Umwelteinflüssen unterscheiden. Man spricht von alternativem Splicing, einer wichtigen Grundlage für eine große Diversität von Proteinen. Das Splicing findet cotranskriptionell statt, was bedeutet, dass Introns bereits entfernt werden, noch während die Polymerase das Gen abliest.
Weitere wichtige Prozesse, die während der Reifung einer prä-mRNA zur mRNA auftreten, sind das Capping: Modifikation des 5'-Endes der RNA mit einem 7-Methylguanosin für eine bessere Stabilität der RNA und wichtig für die Translation am Ribosom.