Induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) sind pluripotente Stammzellen, die durch künstliche Reprogrammierung von nicht-pluripotenten somatischen Zellen entstanden sind. Die Umwandlung wird durch von außen angeregte Expression spezieller Gene (Transkriptionsfaktoren) in der Körperzelle angestoßen, für die verschiedene Techniken existieren. iPS-Zellen ähneln natürlichen Stammzellen in vielen Eigenschaften stark, ob die heutigen iPS-Zellen in allen Eigenschaften mit natürlichen Stammzellen übereinstimmen, ist eine ungeklärte Frage. Induzierte pluripotente Stammzellen haben ein hohes medizinisches Potential, da die Forschung an ihnen weniger ethische Probleme mit sich zieht als die an Embryonalen Stammzellen. Außerdem lassen sich speziell auf Patienten angepasste iPS-Zellen erzeugen.
Nachdem 2006 im Labor des japanischen Stammzellenforschers Shin’ya Yamanaka die ersten iPS-Zellen hergestellt wurden, ist die Forschung an iPS-Zellen heute eines der sich am schnellsten weiterentwickelnden Gebiete der Biologie. Für die Entwicklung induzierter pluripotenter Stammzellen erhielt Shin’ya Yamanaka 2012 den Nobelpreis für Physiologie oder Medizin.Pressemeldung zum Nobelpreis für Medizin 2012, The Nobel Assembly at Karolinska Institutet, 8. Oktober 2012, abgerufen am 8. Oktober 2012 Herstellung von iPS-Zellen
Entdeckung mini|hochkant=2|Schema zur Erzeugung von iPS-Zellen:1) Bilden einer Zellkultur von somatischen Zellen2) Einbringen der Pluripotenzgene in die Zellen durch einen Retrovirus-Vektor. Zellen, die die exogenen Gene exprimieren sind rot eingezeichnet 3) Ernten und Kultivieren der Zellen unter Verwendung von Fütterzellen (grau)4) Ein kleiner Teil der Zellen (rot) wird zu iPS-Zellen. Sowohl Embryonale Stammzellen (ES-Zellen), die mit Körperzellen fusioniert wurden, als auch die Zellen der ersten Zellteilungen nach einem somatischen Zellkerntransfer sind in der Lage, Körperzellen zu einem pluripotenten Zustand umzuprogrammieren. Außerdem war es vor 2006 in mehreren Experimenten gelungen, durch Überexpression bzw. Unterexpression von einzelnen Transkriptionsfaktoren den Zelltyp von somatischen Zellen zu ändern (Transdifferenzierung).S. Yamanaka, H. M. Blau: Nuclear reprogramming to a pluripotent state by three approaches. In: Nature (2010), Bd. 465(7299), S. 704–712. PMID 20535199; .nach Hochedlinger, Plath (2009) Shin’ya Yamanaka stellte auf diesen Grundlagen aufbauend die Hypothese auf, dass Gene, die in ES-Zellen eine besonders wichtige Rolle spielen, auch in der Lage sein könnten, eine Körperzelle in einen pluripotenten Zustand zurückzuversetzen. Zusammen mit Kazutoshi Takahashi führte er Experimente an Fibroblasten des Modellorganismus Maus durch, in denen die Expression von zentralen Transkriptionsfaktoren in Körperzellen dadurch angeregt wurde, dass deren DNA durch ein Retrovirus in das Genom eingebracht wurde (Transduktion).
Ausgehend von insgesamt 24 Kandidaten-Genen konnte er im Experiment zeigen, dass mit einer Kombination aus den vier Genen c-Myc, Klf-4, Oct-4 und Sox-2 (Yamanaka-Faktoren) die Reprogrammierung einiger Zellen in einen pluripotenten Zustand möglich ist.K. Takahashi, S. Yamanaka: Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. In: Cell. Band 126, Nummer 4, August 2006, S. 663–676, . . PMID 16904174. Überraschend war für ihn hierbei, dass das Nanog-Gen, das zur Selbsterneuerung von Stammzellen essentiell ist, nicht benötigt wurde. Die Zellen ähnelten natürlichen Stammzellen stark, waren jedoch nicht in der Lage, nach der Injektion in die Blastozyste eines Maus-Embryo eine lebende Chimäre zu erzeugen. Dies gelang Yamanakas Team Mitte 2007, zeitgleich mit zwei anderen Laboren.K. Okita, T. Ichisaka, S. Yamanaka: Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. In: Nature. Band 448, Nummer 7151, Juli 2007, S. 313–317, . . PMID 17554338.N. Maherali, R. Sridharan u. a.: Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution. In: Cell stem cell. Band 1, Nummer 1, Juni 2007, S. 55–70, . . PMID 18371336.M. Wernig, A. Meissner u. a.: In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. In: Nature. Band 448, Nummer 7151, Juli 2007, S. 318–324, . . PMID 17554336. Die entscheidende Verbesserung in dieser zweiten Generation von iPS-Zellen war, dass zum Erhalt der erfolgreich umgewandelten Zellen nicht Fbx15, sondern Nanog verwendet wurde (der Anteil der erfolgreich reprogrammierten Zellen einer Zellkultur ist sehr gering, er liegt im Promille- bzw. unteren Prozentbereich). Induzierte pluripotente Stammzellen besitzen einen teilweise unterschiedlichen Phänotyp zu embryonalen Stammzellen.P. D. Tonge, A. J. Corso, C. Monetti, S. M. Hussein, M. C. Puri, I. P. Michael, M. Li, D. S. Lee, J. C. Mar, N. Cloonan, D. L. Wood, M. E. Gauthier, O. Korn, J. L. Clancy, T. Preiss, S. M. Grimmond, J. Y. Shin, J. S. Seo, C. A. Wells, I. M. Rogers, A. Nagy: Divergent reprogramming routes lead to alternative stem-cell states. In: Nature. Band 516, Nummer 7530, Dezember 2014, S. 192–197, . . PMID 25503232. Die Umwandlung zu induzierten pluripotenten Stammzellen ist unter anderem von einer Entfernung der Trimethylierung des Lysins im Histon H3 an Position 27 (H3K27me3) begleitet.S. M. Hussein, M. C. Puri, P. D. Tonge, M. Benevento, A. J. Corso, J. L. Clancy, R. Mosbergen, M. Li, D. S. Lee, N. Cloonan, D. L. Wood, J. Munoz, R. Middleton, O. Korn, H. R. Patel, C. A. White, J. Y. Shin, M. E. Gauthier, K. A. Lê Cao, J. I. Kim, J. C. Mar, N. Shakiba, W. Ritchie, J. E. Rasko, S. M. Grimmond, P. W. Zandstra, C. A. Wells, T. Preiss, J. S. Seo, A. J. Heck, I. M. Rogers, A. Nagy: Genome-wide characterization of the routes to pluripotency. In: Nature. Band 516, Nummer 7530, Dezember 2014, S. 198–206, . . PMID 25503233.
Menschliche iPS-Zellen Ende 2007 gelang es unabhängig voneinander mehreren Teams, iPS-Zellen aus menschlichen Körperzellen zu erzeugen.I. H. Park, R. Zhao u. a.: Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. In: Nature. Band 451, Nummer 7175, Januar 2008, S. 141–146, . . PMID 18157115.K. Takahashi, K. Tanabe u. a.: Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. In: Cell. Band 131, Nummer 5, November 2007, S. 861–872, . . PMID 18035408.J. Yu, M. A. Vodyanik u. a.: Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. In: Science. Band 318, Nummer 5858, Dezember 2007, S. 1917–1920, . . PMID 18029452. Diese Studien zeigten auch, dass sich aus menschlichen iPS-Zellen Zellen aller drei Keimblätter gewinnen lassen.
Das Experiment von Yu aus dem Labor James Thomsons hatte die Besonderheit, dass statt der vier Pluripotenzgene Yamanakas eine andere Kombination von Genen aktiviert wurden: Neben Oct4 und Sox-2 waren dies Nanog und Lin-28. Dies zeigte, dass es möglich ist, auf c-Myc verzichten zu können. c-Myc ist ein bekanntes Protoonkogen.
Verbesserungen der Methode Nach der erfolgreichen Reprogrammierung von Fibroblasten wurde gezeigt, dass sich Zellen aus unterschiedlichem Gewebe (Blut, Leber, Gehirn, Pankreas u. a.) zur Pluripotenz umprogrammieren lassen.Referenzen zu Originalarbeiten in Hochedlinger, Plath (2009) Eine große Hürde auf dem Weg zur klinischen Anwendung von iPS-Zellen besteht jedoch darin, dass bei der Transduktion durch Retroviren das Genom der Empfängerzelle verändert wird, was Krebs zur Folge haben kann. Ein weiteres Risiko ist das Protoonkogen c-Myc, das – obwohl nicht unentbehrlich – die Effizienz der Methode stark verbessert.
Aus diesem Grund wurde bald nach Methoden gesucht, die das Genom der Empfängerzelle nicht dauerhaft verändern und so gentechnisch veränderte Organismen zu vermeiden. Ein Ansatz besteht darin, Adenoviren als Vektor zu verwenden statt Retroviren.M. Stadtfeld, M. Nagaya u. a.: Induced pluripotent stem cells generated without viral integration. In: Science. Band 322, Nummer 5903, November 2008, S. 945–949, . . PMID 18818365. Ein anderer Ansatz besteht darin die Gene in Form eines Plasmids in die Zelle zu bringen, so dass die Chromosomen der Zelle nicht verändert werden.K. Okita, M. Nakagawa u. a.: Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors. In: Science. Band 322, Nummer 5903, November 2008, S. 949–953, . . PMID 18845712. Schließlich gelang es Forschern 2009 sogenannte protein-induzierte pluripotente Stammzellen (piPS-Zellen) durch das Einbringen von rekombinanten Proteinen zu erzeugen. Bei dieser Methode produziert die Zelle die notwendigen Proteine nicht selbst durch Translation wie bei allen vorherigen Ansätzen. Stattdessen werden sie – in leicht veränderter Form, damit sie die Zellmembran passieren können – der Zelle von außen zugeführt.H. Zhou, S. Wu u. a.: Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins. In: Cell stem cell. Band 4, Nummer 5, Mai 2009, S. 381–384, . . PMID 19398399. Die meisten dieser alternativen Methoden erreichen jedoch eine weitaus niedrigere Effizienz, als die stabile Transfektion durch die ursprünglichen vier Pluripotenzgene.
Die Erzeugung induzierter pluripotenter Stammzellen wurde von der Zeitschrift Nature Methods zur Methode des Jahres 2009 gekürt.unbekannt: Method of the Year 2009. In: Nature Methods. 7, 2010, S. 1–1, .
Nachweismethoden Zum Nachweis, dass die reprogrammierten Zellen wirklich pluripotente Stammzellen sind, ist eine Reihe von Verfahren notwendig. Man kann zwischen morphologischen, molekularen und funktionellen Nachweismöglichkeiten unterscheiden.K Hochedlinger, K Plath: Epigenetic reprogramming and induced pluripotency. Development 136, 509–523 (2009), PMID 19168672 Morphologisch: Hierbei werden potentielle iPS-Zellen unter dem Mikroskop mit natürlichen ES-Zellen verglichen. Kriterien sind dabei unter anderem die Form der Zellen oder die Zeit zwischen zwei Zellteilungen Molekular: Hier werden die Muster der Transkription sowie das epigenetische Methylierungsmuster von Promotorregionen spezieller Gene zwischen iPS-Zellen und ES-Zellen verglichen. Funktionell: Die Eigenschaft der Pluripotenz wird dadurch nachgewiesen, dass iPS-Zellen in immundefekte Mäuse injiziert werden. Diese bilden spontan Teratome aus, welche Zellen aus allen drei Keimblättern enthalten und somit die Pluripotenz der ursprünglichen Zellen belegen. In einem weiteren wichtigen Test werden iPS-Zellen in Maus-Blastozysten injiziert. Aus funktionellen iPS-Zellen entwickeln sich so lebensfähige Chimären. Da es aus ethischen Gründen nicht in Frage kommt, menschliche Chimären zu erzeugen, ist es schwierig, die Tendenz zur Tumorbildung von menschlichen iPS-Zellen zu testen. iPS Zellen können aber auch mit tetraploiden Blastozysten kombiniert werden. Hierbei können die Blastozysten lediglich Plazentagewebe ausbilden und der Embryo muss aus den iPS-Zellen herstammen. Dieser strengere Test konnte nun mit iPS-Zellen aus Mäusen erfolgreich durchgeführt werden.Lebende Mäuse aus induzierten, pluripotenten Stammzellen
Mechanismus Der genaue Mechanismus des zur Pluripotenz führenden Prozesses ist weitgehend unverstanden. Wegen der geringen Effizienz der Methode ist es schwierig, Zellen gezielt während des graduellen, etwa zehntägigen Prozesses der Reprogrammierung zu verfolgen. Bei den ersten Generationen von iPS-Zellen lag die Erfolgsrate nur bei 0,05 %. Diese Prozentzahl liegt in der gleichen Größenordnung wie der Anteil natürlich vorkommender Stammzellen in einer Population von Hautzellen, so dass die Hypothese aufkam, dass nicht terminal ausdifferenzierte Zellen, sondern seltene natürliche Stammzellen zu iPS-Zellen werden.S Yamanaka: Elite and stochastic models for induced pluripotent stem cell generation. Nature 460, S. 49–52 (2009), PMID 19571877