mini|Proteine der Erythrozytenmembran per SDS-PAGE nach der Molmasse getrennt SDS-PAGE (Abkürzung für , Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese) ist eine Variante der Polyacrylamid-Gelelektrophorese, einer analytischen Methode der Biochemie zur Trennung von Stoffgemischen nach der Molekülmasse in einem elektrischen Feld.
Dieses von Ulrich K. Laemmli entwickelte diskontinuierliche elektrophoretische System ermöglicht eine gute Trennung von Proteinen mit Molekülmassen zwischen 5 und 250 kDa.U. K. Laemmli: Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. In: Nature. Bd. 227, 1970, S. 680–685, , PMID 5432063. Die Publikation, in der es beschrieben wurde, ist das am häufigsten zitierte Paper eines Einzelautors, und das am zweithäufigsten zitierte insgesamt.Interview mit Ulrich Laemmli. In: NZZ Folio. Nr. 11, 2005. Abgerufen am 4. März 2012.
Eigenschaften mini|Denaturierung eines Proteins mit SDS mini|Denaturierung eines Proteins mit Wärme Die SDS-PAGE wird zur Analyse von Proteinen verwendet.B. J. Smith: SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins. In: Methods in Molecular Biology. Band 1, 1984, S. 41–55, , PMID 20512673. Als Trennmedium (auch als Matrix bezeichnet) bei dieser Art der Elektrophorese dient ein diskontinuierliches Gel auf Polyacrylamidbasis. Zusätzlich kommt SDS (Natriumdodecylsulfat) zum Einsatz. Dieses anionische Tensid (Detergens) überdeckt die Eigenladungen von Proteinen. Pro Gramm Protein binden konstant ungefähr 1,4 Gramm SDS,R. Pitt-Rivers, F. S. Impiombato: The binding of sodium dodecyl sulphate to various proteins. In: The Biochemical journal. Band 109, Nummer 5, Oktober 1968, S. 825–830, PMID 4177067, .J. A. Reynolds, Charles Tanford: Binding of dodecyl sulfate to proteins at high binding ratios. Possible implications for the state of proteins in biological membranes. In: Proceedings of the National Academy of Sciences. Band 66, Nummer 3, Juli 1970, S. 1002–1007, PMID 5269225, .Georgios Staikos, Anastasios Dondos: Study of the sodium dodecyl sulphate–protein complexes: evidence of their wormlike conformation by treating them as random coil polymers. In: Colloid and Polymer Science. 287, 2009, S. 1001, . entsprechend einem SDS-Molekül pro zwei Aminosäuren, sodass die Proteine eine konstante negative Ladungsverteilung aufweisen. Die Eigenladungen der Proteine sind unter der SDS-Beladung vernachlässigbar, die positiven Ladungen sind zudem im basischen pH-Wert-Bereich eines Trenngels nach Laemmli stark verringert. Die negativen Ladungen des SDS bewirken deren gegenseitige Abstoßung, was zusammen mit der Denaturierung durch Aufkochen zu einer Linearisierung der zuvor gefalteten Proteine führt. Dies erlaubt eine Auftrennung nach der Kettenlänge, proportional zur Molekülmasse, denn längere Proteine werden im Gel stärker zurückgehalten als kürzere.
SDS neigt in wässrigen Lösungen ab einer bestimmten Konzentration zur Bildung kugelförmiger Mizellen. SDS kommt in Lösungen ab der kritischen Mizellenbildungskonzentration von 7 bis 10 Millimolar gleichzeitig als einzelne Moleküle (Monomer) und als Mizellen vor, darunter kommt SDS nur einzeln vor. Bei der kritischen Mizellenbildungskonzentration besteht eine Mizelle aus etwa 62 SDS-Molekülen.Nicholas J. Turro, Ahmad Yekta: Luminescent probes for detergent solutions. A simple procedure for determination of the mean aggregation number of micelles. In: Journal of the American Chemical Society. 100, 1978, S. 5951, . Allerdings binden nur SDS-Monomere über hydrophobe Wechselwirkungen an Proteine, während die auf der Außenseite anionischen SDS-Mizellen kein Protein aufnehmen. In SDS-Konzentrationen über 0,1 Millimolar beginnt die Entfaltung von Proteinen, oberhalb von 1 mM werden die meisten Proteine denaturiert. Wegen des starken Denaturierungseffekts von SDS und der folgenden Aufspaltung von Proteinkomplexen können in der Regel mit SDS keine Quartärstrukturen bestimmt werden. Ausnahmen bilden z. B. zuvor durch kovalente Quervernetzung stabilisierte Proteine und die SDS-resistenten Proteinkomplexe, die auch in Gegenwart von SDS stabil sind (Letztere jedoch nur bei Raumtemperatur). Die SDS-Resistenz basiert auf der Metastabilität: Um die resistenten Komplexe zu denaturieren, ist eine hohe Aktivierungsenergie erforderlich, die durch Erhitzen erreicht wird. Obwohl das native, vollständig gefaltete, SDS-resistente Protein unter den Bedingungen keine ausreichende Stabilität besitzt, stellt sich das chemische Gleichgewicht der Denaturierung bei Raumtemperatur nur langsam ein. Stabile Proteinkomplexe zeichnen sich neben der SDS-Resistenz auch noch durch Stabilität gegen Proteasen und eine erhöhte biologische Halbwertszeit aus.Marta Manning, Wilfredo Colón: Structural basis of protein kinetic stability: resistance to sodium dodecyl sulfate suggests a central role for rigidity and a bias toward beta-sheet structure. In: Biochemistry. Bd. 43, 2004, S. 11248–11254, PMID 15366934.
Alternativ kann teilweise auch eine Polyacrylamid-Gelelektrophorese mit den kationischen Tensiden CTAB in einer CTAB-PAGEEngelbert Buxbaum: Cationic electrophoresis and electrotransfer of membrane glycoproteins. In: Analytical Biochemistry. Bd. 314, Nr. 1, 2003, S. 70–76, PMID 12633604, .Dianne T. Akin, Raymond Shapira, Joseph M. Kinkade Jr.: The determination of molecular weights of biologically active proteins by cetyltrimethylammonium bromide-polyacrylamide gel electrophoresis. In: Analytical Biochemistry. Bd. 145, Nr. 1, 1985, S. 170–176, PMID 4003759, .Richard J. Simpson: CTAB-PAGE. In: Cold Spring Harbor protocols. Band 2010, Nummer 4, April 2010, S. pdb.prot5412, , PMID 20360366. oder 16-BAC in einer BAC-PAGE verwendet werden.Joachim Hartinger, Katinka Stenius, Dagmar Högemann, Reinhard Jahn: 16-BAC/SDS-PAGE: a two-dimensional gel electrophoresis system suitable for the separation of integral membrane Proteins. In: Analytical Biochemistry. Bd. 240, Nr. 1, 1996, S. 126–133, PMID 8811889, .
Physikalische und chemische Grundlagen
In einem elektrischen Feld wandern geladene Teilchen in Lösung zum Pol mit der entgegengesetzten Ladung. Durch die Beladung von Proteinen mit SDS sind sie mit mehreren negativen Ladungen behaftet, weshalb Proteine in der SDS-PAGE zum Plus-Pol wandern. Durch Verwendung eines ungeladenen polymeren Hydrogels (Polyacrylamid) kommt ein verstärkter Siebeffekt hinzu. Die Porengröße im Hydrogel wird durch die Konzentrationen an Monomer und Vernetzer bestimmt. Für die Elektrophorese wird das Gel durch radikalische Polymerisation aus den Stoffen Acrylamid und N,N′-Methylenbisacrylamid (gewöhnlich im Verhältnis 37,5:1) hergestellt. Letzteres dient zur Quervernetzung der ansonsten linearen Polyacrylamid-Ketten. Nur so entsteht ein starres Gel. Der durchschnittliche Porendurchmesser eines Polyacrylamidgels wird durch zwei Parameter bestimmt, die Gesamtkonzentration an Acrylamiden (%T mit T = Totale Konzentration von Acrylamid und Bisacrylamid) und die Konzentration des Vernetzers Bisacrylamid (%C mit C = Bisacrylamidkonzentration).Reinhard Rüchel, Russell L. Steere, Eric F. Erbe: Transmission-electron microscopic observations of freeze-etched polyacrylamide gels. In: Journal of Chromatography A. 166, 1978, S. 563, . Die Porengröße ist umgekehrt proportional zu %T. Mit steigendem %T nimmt die Porengröße ab. Bei %C ergibt eine Konzentration von 5 % die kleinsten Poren. Der Einfluss des Bisacrylamids auf die Porengröße ergibt eine Parabel-förmige Kurve mit dem Vertex bei 5 %. Wenn man an Stelle von N,N′-Methylenbisacrylamid N,N′-Diallyltartardiamid verwendet, dann kann man das Gel nach dem Trennlauf mit Natriumperiodatlösung durch Glycolspaltung wieder auflösen, was die Untersuchung der getrennten Substanzen erleichtert.H. S. Anker: A solubilizable acrylamide gel for electrophoresis. In: FEBS letters. Band 7, Nummer 3, April 1970, S. 293, , PMID 11947496. Ebenso wird Bis-Acryloylcystamin als spaltbarer Vernetzer verwendet.N. Takemori, A. Takemori, P. Wongkongkathep, M. Nshanian, R. R. Loo, F. Lermyte, J. A. Loo: Top-down/Bottom-up Mass Spectrometry Workflow Using Dissolvable Polyacrylamide Gels. In: Analytical chemistry. Band 89, Nummer 16, August 2017, S. 8244–8250, , PMID 28723075, .
Verfahren Das Verfahren der SDS-PAGE setzt sich aus der Gelherstellung, der Probenvorbereitung, der Elektrophorese, der Proteinfärbung oder einem Western Blot und der Analyse des erzeugten Bandenmusters zusammen.
Gelherstellung mini|Probenkämme mit unterschiedlicher Taschenanzahl, jeder Zinken hinterlässt beim Herausziehen eine Tasche im Gel mini|Fertiges Trenn- und Sammelgel vor dem Entfernen des Probenkamms, im Sammelgel befinden sich geringe Mengen an Bromphenolblau, das Trenngel ist ungefärbt Bei Verwendung unterschiedlicher Puffer im Gel (diskontinuierliche Gelelektrophorese) werden die Gele bis zu einem Tag vor der Elektrophorese hergestellt, damit die Diffusion nicht zu einer Vermischung der Puffer führt. Das Gel wird durch radikalische Polymerisation in einer Form erzeugt, die aus zwei abgedichteten Glasplatten mit Abstandshaltern zwischen den Glasplatten besteht. Die Abstandshalter besitzen eine Dicke von 0,75 mm oder 1,5 mm, welche die Ladekapazität des Gels bestimmt. Die Platten werden meistens für das Gießen der Gellösung in einen Ständer eingespannt, der die sonst offene Unterseite der Glasplatten mit den beiden Abstandshaltern vorübergehend abdichtet. Für die Gellösung werden Acrylamid als Gelbildner (meistens 4 % V/V im Sammelgel und 10–12 % im Trenngel), Methylenbisacrylamid als Quervernetzer, Sammel- oder Trenngelpuffer sowie Wasser und SDS gemischt. Durch Zugabe des Katalysators TEMED und des Radikalstarters Ammoniumpersulfat (APS) wird die Polymerisation begonnen. Die Lösung wird anschließend blasenfrei zwischen die Glasplatten gegossen. Je nach Menge an Katalysator und Radikalstarter sowie je nach Temperatur dauert die Polymerisation zwischen einer viertel Stunde und mehreren Stunden. Das untere Gel (Trenngel) wird zuerst gegossen und mit ein paar Tropfen von einem wenig wasserlöslichen Alkohol (meistens puffergesättigtes Butanol oder Isopropanol) überschichtet, wodurch der Meniskus blasenfrei wird und vor dem Radikalfänger Sauerstoff geschützt wird. Nach der Polymerisation des Trenngels wird der Alkohol abgekippt und die Reste mit Filterpapier entfernt. Nach Zugabe von APS und TEMED zur Sammelgellösung erfolgt das Gießen der Sammelgellösung auf das feste Trenngel und das blasenfreie Einsetzen eines geeigneten Probenkamms. Teilweise werden anionische Farbstoffe (Tartrazin,M. Hagiwara: Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis and western blotting analyses via colored stacking gels. In: Analytical biochemistry. Band 652, September 2022, S. 114751, , PMID 35667451. Brillantblau FCF, Cochenillerot A oder Bromphenolblau) der Sammelgellösung zugesetzt, um den Kontrast zwischen Sammelgel und den Taschen für den Probenauftrag zu verstärken. Der Probenkamm wird nach der Polymerisation vorsichtig herausgezogen, wodurch Taschen für den Probenauftrag entstehen. Für eine spätere Verwendung der Proteine für eine Proteinsequenzierung werden die Gele oftmals am Vortag der Elektrophorese hergestellt, um Reaktionen von unpolymerisiertem Acrylamid mit Cysteinen in Proteinen zu mindern.