Der In-Gel-Verdau ist Bestandteil der Probenvorbereitung zur massenspektrometrischen Analyse von Proteinen im Rahmen von Proteomanalysen. Der In-Gel-Verdau umfasst im Wesentlichen die vier Schritte Entfärbung, Reduktion und Alkylierung (R&A) der in den Proteinen enthaltenen Cysteine, proteolytische Spaltung der Proteine und Gelextraktion der erzeugten Peptide.
Die Methode wurde 1992 von Rosenfeld et al. eingeführt.J. Rosenfeld, J. Capdevielle, J. C. Guillemot, P. Ferrara: In-gel digestion of proteins for internal sequence analysis after one- or two-dimensional gel electrophoresis. In: Analytical Biochemistry (1992), Band 203, Ausgabe 1, S. 173–179. PMID 1524213. Trotz unzähliger Veränderungen und Verbesserungen des Verfahrens haben sich die grundlegenden Bestandteile bis heute weitgehend erhalten.P. Jenö, T. Mini, S. Moes, E. Hintermann, M. Horst: Internal sequences from proteins digested in polyacrylamide gels. In: Anal Biochem. (1995), Band 224, Ausgabe 1, S. 75–82. PMID 7710119.A. Shevchenko, M. Wilm, O. Vorm, M. Mann: Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. In: Analytical Chemistry (1996), Band 68, Ausgabe 5, S. 850–858. PMID 8779443.C. Borchers, J. F. Peter, M. C. Hall, T. A. Kunkel, K. B. Tomer: Identification of in-gel digested proteins by complementary peptide mass fingerprinting and tandem mass spectrometry data obtained on an electrospray ionization quadrupole time-of-flight mass spectrometer. In: Anal Chem. (2000), Band 72, Ausgabe 6, S. 1163–1168. PMID 10740854.A. Shevchenko, H. Tomas, J. Havlis, J. V. Olsen, M. Mann: In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. In: Nature Protocols (2006), Band 1, Ausgabe 6, S. 2856–2860. PMID 17406544.B. Granvogl, P. Gruber, L. A. Eichacker: Standardisation of rapid in-gel digestion by mass spectrometry. In: Proteomics (2007), Band 7, Ausgabe 5, S. 642–654. PMID 17340585.
Prinzip Entfärbung Nach dem Ausschneiden der mittels 1D bzw. 2D PAGE separierten und mit Farbstoffen (zum Beispiel Coomassie-Brillant-Blau (CBB) oder Silber) visualisierten Proteinbanden bzw. -spots erfolgt eine Entfärbung der Proteine. Die Verwendung von Coomassie zur Visualisierung von Proteinen bereitet die wenigsten Probleme in der nachfolgenden massenspektrometrischen Analyse. Deshalb ist die Methode trotz ihrer geringeren Sensitivität weit verbreitet.
Die Entfärbelösung für CBB enthält in der Regel das Puffer-Salz Ammoniumhydrogencarbonat (NH4HCO3) und einen Anteil von 30–50 % organisches Lösungsmittel (meist Acetonitril). Die hydrophoben Wechselwirkungen zwischen Protein und Coomassie-Farbstoff werden im organischen Lösungsmittel herabgesetzt.Y. Jin, T. Manabe, in: Electrophoresis 2005, 26, 1019–1028. Zugleich reduziert der Salzanteil die elektrostatischen Interaktionen zwischen den Farbstoffmolekülen und den positiv geladenen Aminosäuren der Proteine. Im Vergleich zu einem Gemisch aus Wasser und organischem Lösungsmittel wird die Effektivität der Entfärbung verbessert. Eine Erhöhung der Temperatur begünstigt den Entfärbungsprozess.M. D. Lloyd, in: Anal. Biochem. 1996, 241, 139–40. Die Entfärbung ist meist mit einem Verlust von unter zehn Prozent des Proteins verbunden.K. D. Speicher, in: J. Biomol. Tech. 2000, 11, 74–86. Zudem verbessert die Entfernung des Farbstoffs grundsätzlich nicht die Peptidausbeute.D. E. Terry, in: Journal of the American Chemical Society of Mass Spectrometry 2004, 15, 784–94.
Im Falle silbergefärbter Banden erfolgt die Entfärbung durch die Oxidation des an die Proteine angelagerten metallischen Silbers mit Hilfe von Kaliumhexacyanidoferrat(III) oder Wasserstoffperoxid (H2O2).F. Gharahdaghi, in: Electrophoresis 1999, 20, 601–5.L. W. Sumner, in: Rapid Commun. Mass Spectrom. 2002, 16, 160–8. Die freiwerdenden Schwermetallionen werden nachfolgend mit Natriumthiosulfat komplexiert.
Reduktion und Alkylierung An die Färbung und Entfärbung der Proteine wird oft eine Reduktion und Alkylierung der potentiell enthaltenen Cystine bzw. Cysteine angeschlossen. Dabei werden die Disulfidbrücken des Proteins getrennt und damit eine optimale Entfaltung des Proteins erreicht. Die Reduktion zum Thiol wird über die Reaktion mit Chemikalien erreicht, die Sulfhydryl- oder Phosphingruppen (zum Beispiel Dithiothreitol (DTT) oder Tris-2-Carboxyethylphosphin-Hydrochlorid (TCEP)) enthalten. Im Zuge der nachfolgenden irreversiblen Alkylierung der SH-Gruppen mit Iodacetamid werden die Cysteine in das stabile S-Carboxyamidomethylcystein (CAM; Addukt: -CH2-CONH2) übergeführt. Damit erhöht sich die spezifische Masse für die Aminosäure Cystein von 103,01 auf 160,03 Da.
Durch die Modifikation wird bei Proteinen mit einer hohen Anzahl an Disulfidbrücken die Identifikation und eine maximale Peptidausbeute und Sequenzabdeckung sichergestellt.J. E. Hale, in: Anal. Biochem. 2004, 333, 174–81.H. Katayama, in Rapid Commun. Mass Spectrom. 2004, 18, 2388–2394. Wegen der relativen Seltenheit der Aminosäure Cystein bringt dieser Schritt für einen großen Teil der Proteine keine deutliche Verbesserung.J. Havlis, in: Anal. Chem., 2003, 75, 1300–6.A. Shevchenko, in: Anal. Biochem., 2001, 296, 279–83. Für eine quantitative und homogene Alkylierung der Cysteine ist der Zeitpunkt der Modifikation entscheidend. Bei der denaturierenden Elektrophorese bietet es sich an, die Reaktion vor der Trennung durchzuführen, da freie Acrylamid-Monomere ebenfalls Cysteine modifizieren können.M. Hamdan, in: Electrophoresis 2001, 22, 1633–1644.R. Mineki, in: Proteomics 2002, 2, 1672–1681.S. Sechi, B. T. Chait, in: Anal. Chem. 1998, 70, 5150–8.B. Herbert, in: Electrophoresis 2001, 22, 2046–2057. Die entstehenden Acrylamid-Addukte werden ebenfalls irreversibel an die Cysteine gebunden. Die spezifische Masse des Addukts beträgt 174,05 Da.
In-Gel-Verdau Anschließend erfolgt der für die Methode namensgebende Schritt, der In-Gel-Verdau des Proteins. Das Protein wird hierbei enzymatisch in eine definierte Anzahl kürzerer Fragmente mit charakteristischer Masse (Peptide) gespalten, die zu seiner Identifikation verwendet werden können. Die Serinprotease Trypsin ist dabei die in der Proteomanalytik am weitesten verbreitete Protease. Trypsin spaltet Peptidbindungen spezifisch am Carboxyende der basischen Aminosäuren Arginin und Lysin. Befindet sich unmittelbar benachbart zur Schnittstelle eine saure Aminosäure (Aspartat oder Glutamat), wird die Hydrolyserate eingeschränkt. Keine Spaltung erfolgt bei einem C-terminal zur Schnittstelle gelegenen Prolin.B. Thiede, in: Rapid Commun. Mass Spectrom. 2000, 14, 496–502.
Als unerwünschter Nebeneffekt tritt beim proteolytischen Verdau der Eigenverdau der Protease auf. Um dies zu verhindern wurden dem Verdaupuffer früher Ca2+-Ionen zugesetzt.T. Vajda, A. Garai, in: Inorg. Biochem. 1981, 15, 307–15.T. Sipos, J. R. Merkel, in: Biochemistry 1970, 9, 2766–2775. Heute wird von den meisten Herstellern modifiziertes Trypsin angeboten. Durch selektive Methylierung der im Trypsin enthaltenen Lysine kann der Eigenverdau auf dessen argininhaltige Peptide beschränkt werden.R. H. Rice, in: BBA 1977, 492, 316–321. Unmodifiziertes Trypsin hat seine höchste Aktivität zwischen 35 und 45 °C. Nach der Modifikation verschiebt sich das Temperaturoptimum auf 50 bis 55 °C.E. J. Finehout, in: Proteomics 2005, 5, 2319–2321. Neben Trypsin finden unter anderem die Endoproteasen Lys-C,W. P. Michalski, B. J. Shiell, in: Analytica Chimica Acta 1999, 383, 27–46.P. A. Jekel, in: Analytical Biochemistry 1983, 134, 347–54.S. D. Patterson, in: Electrophoresis 1995, 16, 1104–1114. Glu-C,C. Scheler, in: Electrophoresis 1998, 19, 918–27.J. Houmard, G. R. Drapeau, in: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1972, 69, 3506–9.M. A. Farah, in: Biochim. Biophys. Acta 2005, 1725, 269–82. und Asp-NL. Wang, in: Pharm. Res. 2005, 22, 1338–1349. Verwendung. Diese Proteasen schneiden spezifisch nur an einer Aminosäure. Damit erhält man eine begrenzte Anzahl an längeren Peptiden.
Die Analyse der kompletten Primärsequenz eines Proteins mit nur einer Protease ist in der Regel nicht möglich. In diesem Fall kann das Zielprotein in mehreren Ansätzen mit unterschiedlichen Proteasen verdaut werden. Dabei werden partiell überlappende Peptide generiert, die anschließend zur Gesamtsequenz zusammengesetzt werden können.G. Choudhary, in: J. Proteome Res. 2003, 2, 59–67.C. Wa, in: Anal. Biochem. 2006, 349, 229–41.
Für den Verdau müssen die im Gel fixierten Proteine für die Protease zugänglich gemacht werden. Um das Eindringen des Enzyms zu erleichtern werden die Gelstücke zunächst mit Acetonitril dehydratisiert und nachfolgend in einem proteasehaltigen Verdaupuffer gequollen. Die Methode beruht auf der Annahme, dass beim Quellungsvorgang die Protease mit in das Gel aufgenommen wird.U. Hellman, in: Anal. Biochem. 1995, 224, 451–5. Das Eindringen der Protease in die Gelmatrix ist jedoch ein weitgehend diffusionsabhängiger Prozess. Das Trocknen des Gels scheint den Vorgang der Diffusion deshalb nicht zu unterstützen. Zur Optimierung des In-Gel-Verdaus bietet sich folglich eine maximale Zerkleinerung der Gelmatrix an, um die Diffusionsstrecke für die Protease drastisch zu verringern.
Der In-Gel-Verdau findet in der Regel über Nacht statt. Bei Verwendung von Trypsin als Protease und einer Temperatur von 37 °C beträgt die Inkubationszeit etwa 12–15 Stunden. Versuche haben jedoch gezeigt, dass bereits nach drei Stunden genug Material für die massenspektrometrische Analyse vorhanden ist.E. J. Finehout, K. H. Lee, in: Electrophoresis 2003, 24, 3508–3516. Die Optimierung der Bedingungen für die Protease (pH, Temperatur) erlaubt den vollständigen Verdau einer Probe aber auch in 30 Minuten.
Extraktion Nach Beendigung des Verdauprozesses müssen die entstandenen Peptide aus der Gelmatrix extrahiert werden. Dies geschieht meist in zwei Extraktionsschritten. Hierbei werden die Gelpartikel in einer Extraktionslösung inkubiert und die aus den Gelpartikeln herausgelösten Peptide mit dem Überstand abgehoben. Die Hauptmenge an Peptid wird bereits mit einem Extraktionsschritt erhalten. Zusätzliche Extraktionen verbessern die Peptid-Ausbeute zusammengenommen nur etwa um fünf bis zehn Prozent. Um die Extraktion von Peptiden mit unterschiedlichen physikalisch-chemischen Eigenschaften zu gewährleisten, werden serielle Extraktionen in basischen bzw. sauren Lösungen durchgeführt. Für die Extraktion der sauren Peptide findet eine in Konzentration und Zusammensetzung zum Verdaupuffer analoge Lösung Verwendung; die basischen Peptide werden in Abhängigkeit von der Art der MS-Analyse entweder mit Ameisensäure (ESI) oder mit Trifluoressigsäure (MALDI) in niedriger Konzentration extrahiert. Anhand von Modellproteinen wurde belegt, dass etwa 70–80 % der zu erwartenden Peptidmenge aus dem Gel extrahiert werden. Viele Protokolle enthalten zur Extraktion zusätzlich einen Anteil an Acetonitril, das ab einer Konzentration von 30 % (v/v), die Adsorption von Peptiden an die Oberflächen von Reaktionsgefäßen und Pipettenspitzen vermindert.H. Erdjument-Bromage, in: J. Chromatogr. A 1998, 826, 167–81. Die vereinigten Extrakte werden anschließend in einer Vakuumzentrifuge bis zur Trockene eingedampft. Wurde das volatile Ammoniumhydrogencarbonat als Puffersalz zur basischen Extraktion verwendet, so wird dieses während des Trocknungsprozesses zum Teil entfernt. In der getrockneten Form können die isolierten Peptide bei −20 °C mindestens sechs Monate gelagert werden.
Probleme Entscheidende Nachteile der Methoden zum In-Gel-Verdau sind aufgrund der multiplen Bearbeitungsschritte die Anfälligkeit für Kontaminationen (v. a. Keratin) und der hohe Zeitbedarf. Diese Nachteile konnten durch die Entwicklung optimierter Protokolle und spezialisierter Reaktionsgefäße gemindert werden.