DNA-Barcoding () ist eine taxonomische Methode zur Artenbestimmung anhand der DNA-Sequenz eines Markergens.Paul D. N. Hebert, Alina Cywinska, Shelley L. Ball, Jeremy R. de Waard: Biological identifications through DNA barcodes. In: Proceedings of the Royal Society London Series B. Band 270, 2003, S. 313–321.
Die Abfolge der Basenpaare wird dabei analog wie der Strichcode auf Lebensmittel-Verpackungen als Kennzeichen für eine bestimmte Art verwendet. Der Name Barcoding (englisch bar „Balken“) entstammt dieser Analogie. Da sich die DNA-Sequenz mit einer im Großen und Ganzen gleichmäßigen Rate durch Punktmutationen verändert (vgl. molekulare Uhr), besitzen näher verwandte Individuen (und Arten) ähnlichere Sequenzen. Solange eine Art ungeteilt bleibt, d. h., einen gemeinsamen Genpool besitzt, werden Unterschiede zwischen verschiedenen Populationen durch Genfluss immer wieder ausgeglichen. Mit der Separation bei der Artbildung entwickeln sich die Sequenzen mit annähernd konstanter Rate auseinander. Besitzen also Proben aus zwei Individuen deutlich unterschiedliche Sequenzen, ist dies ein Zeichen, dass sie aus verschiedenen Arten stammen.
Beim DNA-Barcoding geht es nicht um die proteincodierende Eigenschaft der DNA. Da codierende Sequenzen der Selektion unterliegen, steht ihre Verwendung sogar unter Vorbehalten. Sie ist dennoch möglich, weil der genetische Code in der dritten Position des Basentripletts zu großen Teilen redundant ist („degenerierter Code“). Dadurch unterliegt die Sequenz hier kaum der Wirkung der Selektion und kann als neutraler Marker verwendet werden. Für die Detektion von Unterschieden zwischen nah verwandten Arten ist eine sich schnell verändernde Basensequenz, z. B. aus einem funktionslosen DNA-Abschnitt, am besten geeignet. Für größere Unterschiede eignen sich langsam verändernde Abschnitte besser. Für die Methode wurden demgemäß verschiedene DNA-Abschnitte vorgeschlagen.
Verschiedene Genregionen werden verwendet, um die verschiedenen Organismengruppen mithilfe von Barcoding zu identifizieren. Die am häufigsten verwendete Region für Tiere und einige Protisten ist ein Abschnitt aus der mitochondrialen DNA (mtDNA). Diese hat den Vorteil, dass sie keine Introns enthält, nur sehr wenig der Rekombination unterliegt, im haploiden Modus vererbt wird und in hoher Kopienzahl vorliegt. Von den 13 proteincodierenden Genen der mtDNA wird als Standard eine 648 Basenpaare lange Region des Gens der Untereinheit I der Cytochrom c Oxidase (COI oder cox1) verwendet,Dirk Steinke, Nora Brede: DNA-Barcoding. In: Biologie in unserer Zeit. Bd. 36, Nr. 1, 2006, S. 40–46. doi:10.1002/biuz.200410302 weil dieses Gen zwischen verschiedenen Arten stärkere Unterschiede aufweist als die anderen mitochondrialen Gene. Andere für das DNA-Barcoding geeignete Gene sind der internal transcribed spacer (ITS) der rRNA, der häufig für Pilze verwendet wird, und RuBisCO, das für Pflanzen verwendet wird. Die mitochondriale DNA ist bei Pflanzen weniger geeignet, da sie hoch konserviert ist. Mikroorganismen werden anhand verschiedener Genregionen nachgewiesen. Das 16S-rRNA-Gen wird häufig zur Identifizierung von Prokaryoten verwendet, während das 18S-rRNA-Gen hauptsächlich zum Nachweis mikrobieller Eukaryoten eingesetzt wird.
Durchführung Das Verfahren beruht auf der Anwendung der Polymerase-Kettenreaktion (abgekürzt PCR nach englisch polymerase chain reaction). Folgende Arbeitsschritte sind erforderlich: Extraktion der DNA aus dem untersuchten Organismus oder der Probe (vgl. Hauptartikel DNA-Extraktion). Hierzu kann frisches Material oder Museumsmaterial dienen. Durchführung der Polymerase-Kettenreaktion. Voraussetzung sind, wie oben diskutiert, geeignete DNA-Abschnitte. Für deren Amplifikation werden zuvor zwei Primer synthetisiert. Eigentlich scheint es so, dass die Auswahl der Primer eine unmögliche Aufgabe sein müsste; schließlich hängt er von der Basensequenz der DNA ab, die ja unbekannt ist und mit der Methode gerade herausgefunden werden soll. Glücklicherweise sind im Genom zahlreiche Abschnitte eingestreut, die zwischen verschiedenen Organismen nur sehr wenig variabel sind. Diese konservierten Sequenzen codieren meist für eine biologisch grundlegende Aufgabe, so dass sich Mutationen an dieser Stelle meist letal auswirken. Das für die Vervielfältigung genutzte Enzym ist die Taq-Polymerase des Bakteriums Thermus aquaticus, die für den Routineeinsatz seit 1987 zur Verfügung steht – eine wesentliche Voraussetzung für die Methodik. Sequenzierung der vervielfältigten (oder „amplifizierten“) DNA (vgl. Hauptartikel DNA-Sequenzierung). Dies war früher eine diffizile Laboraufgabe. Heute stehen leistungsfähige Sequenzierautomaten mit hoher Durchsatzrate zur Verfügung, die die Sequenzierung automatisch durchführen. Die Sequenzierung trägt daher heute weder zu den Schwierigkeiten noch zu den Kosten der Methode noch Nennenswertes bei. Analyse der Sequenz. Liegt bereits eine Datenbank für die untersuchte Gruppe vor, wird die Sequenz mit den dort gespeicherten Sequenzen verglichen. Ist sie identisch oder weist nur geringe Variationen auf, gehört die untersuchte Probe wahrscheinlich zu dieser Art. Schwieriger ist es, wenn gar keine Datenbank vorliegt bzw. diese mit den Proben gerade erstellt werden soll, oder wenn die Probe keine Übereinstimmung mit den gespeicherten Sequenzen aufweist. Unbekannte Proben werden vom Computer nach Sortieralgorithmen abgestuft nach Ähnlichkeit gruppiert, so dass sich Bäume ergeben, die einem Stammbaum ähneln. Proben aus derselben Art oder aus sehr nahe verwandten Arten sollten ähnliche Sequenzen aufweisen und daher bei der Sortierung nahe beieinander liegen. Weisen die Proben von einer „Art“ zwei oder mehr deutlich getrennte Gruppen (oder „Cluster“) auf, ist dies ein starker Hinweis darauf, dass hier in Wirklichkeit mehrere Arten vorliegen, die bisher nicht erkannt und unterschieden worden waren. Unglücklicherweise ist der Unterschied zwischen verschiedenen Arten in unterschiedlichen systematischen Gruppen sehr unterschiedlich groß, und gleichzeitig kann der Polymorphismus innerhalb einer Art manchmal recht groß sein. Es ist deshalb nicht möglich, eine universelle Schwelle anzugeben, ab der divergierende Sequenzen mit Sicherheit verschiedene Arten repräsentieren. In der Größenordnung hat sich vielfach ein Unterschied von 3 % bewährt, aber sowohl niedrigere als auch höhere Werte sind vielfach in Gebrauch. Was die Cluster der Datenanalyse, manchmal operational taxonomic units (OTUs) genannt, wirklich repräsentieren und ob man sie ohne weiteres mit Arten gleichsetzen darf, gehört zu den größten Streitpunkten des Verfahrens.
Anwendungen Es gibt weltweit eine Reihe von Initiativen, die für bestimmte Artengruppen Datenbanken mit DNA-Barcode-Sequenzen als Referenzen aufbauen. Ziel der Initiativen ist es vor allem, Sequenzen von zweifelsfrei bestimmten Individuen beschriebener Arten zu sammeln und einzulesen, um Daten für Anwender bereitzustellen. Die Initiative IBOL (International Barcode of Life) koordiniert die Bemühungen in zahlreichen Artengruppen und leistet technische Hilfe. Einige teilnehmende Initiativen sind: Die Fish Barcode of Life Initiative (FISH-BOL) versucht, eine Datenbank mit DNA-Barcodes für weltweit alle Fischarten aufzubauen. ABBI ist die entsprechende Initiative für die die Vögel.barcodingbirds.org Andere IBOL-Initiativen versuchen dasselbe für die Schmetterlinge und die Säugetiere.
Diese Datenbanken sind Voraussetzung für das Metabarcoding. Metabarcoding, eine Methode der Metagenomik, ist Barcodierung in einer Weise, die die gleichzeitige Identifizierung vieler Taxa innerhalb derselben Probe ermöglicht. Der Hauptunterschied zwischen Barcoding und Metabarcoding besteht darin, dass Metabarcoding sich nicht auf einen bestimmten Organismus konzentriert, sondern darauf abzielt, die Artenzusammensetzung innerhalb einer Probe zu bestimmen.Alice Valentini, Francois Pompanon, Pierre Taberlet: DNA barcoding for ecologists. In: Trends in Ecology & Evolution. Band 24, Nr. 2, 2009, S. 110–117.
Fallbeispiele
Eine Untersuchung des neotropischen Schmetterlings Astraptes fulgerator mittels DNA-Barcoding hat ergeben, dass das, was bisher für eine (polymorphe) Art gehalten worden ist, in Wirklichkeit einen Komplex aus zehn sehr ähnlichen Zwillingsarten darstellt, die morphologisch kaum unterscheidbar sind.Paul D. N. Hebert, Erin H. Penton, John M. Burns, Daniel H. Janzen, Winnie Hallwachs: Ten species in one: DNA barcoding reveals cryptic species in the neotropical skipper butterfly Astraptes fulgerator. In: Proceedings of the National Academy of Sciences USA. Band 101, Nr. 41, 2004, S. 14812–14817.
In einer Studie an tropischen parasitoiden Brackwespen konnten mit morphologischen Methoden 171 provisorische (zu ca. 95 % unbeschriebene) Arten unterschieden werden. DNA-Barcoding ergab das Vorhandensein von weiteren 142 Arten, die bei der morphologischen Sortierung nicht erkannt werden konnten, die meisten davon wirtsspezifisch. Die Studie lässt Hochrechnungen auf die extreme Artenfülle dieser Gruppe in den Tropen zu, auf die weltweit nur extrem wenige Taxonomen spezialisiert sind.M. Alex Smith, Josephine J. Rodriguez, James B. Whitfield, Andrew R. Deans, Daniel H. Janzen, Winnie Hallwachs, Paul D. N. Hebert: Extreme diversity of tropical parasitoid wasps exposed by iterative integration of natural history, DNA barcoding, morphology, and collections. In: Proceedings of the National Academy of Science USA. Band 105, Nr. 34, 2008, S. 12359–12364.
Die Eignung der Methode konnte für die Artidentifikation mariner Rotalgen nachgewiesen werden. Diese sind nach morphologischen Kriterien nur extrem schwierig unterscheidbar.Lavinia Robba, Stephen J. Russell, Gary, L. Barker, Juliet Brodie: Assessing the use of the mitochondrial cox1-marker for use in DNA barcoding of red algae (Rhodophyta). In: American Journal of Botany. Band 93, Nr. 8, 2006, S. 1101–1108.
Bei Landpflanzen ist das cox1-Gen für DNA-Barcoding ungeeignet, da es hoch konserviert ist. Für die Methode wurde eine Reihe anderer Gene getestet, darunter ein Abschnitt des Plastid-Gens matKKhidir W. Hilu, Hongping Liang: The matK gene: sequence variation and application in plant systematics. In: American Journal of Botany. Band 84, Nr. 6, 1997, S. 830–839. (Plastiden besitzen ebenso wie Mitochondrien eigenes Erbmaterial). In einer Pilotstudie an Orchideenarten konnte die Eignung dieses Gens für DNA-Barcoding von Landpflanzen nachgewiesen werden. Marker für tropische Orchideenarten könnten in der Anwendung ein wichtiger Baustein zum Verhindern von Schmuggel sein.Renaud Lahaye, Michelle van der Bank, Diego Bogarin, Jorge Warner, Franco Pupulin, Guillaume Gigot, Olivier Maurin, Sylvie Duthoit, Timothy G. Barraclough, Vincent Savolainen: DNA barcoding the floras of biodiversity hotspots. In: Proceedings of the National Academy of Science USA. Band 105, Nr. 8, 2008, S. 2923–2928. Eine weitere Arbeitsgruppe fand allerdings bei Bäumen der auch ökonomisch bedeutsamen Familie Meliaceae (Mahagonigewächse), dass alle Marker auf Mitochondrien und Plastiden gleichermaßen unzuverlässig waren. Sie waren aber mit einem nukleären Sequenzbereich erfolgreich der für einen internal transcribed spacer der rRNA codiert.A. N. Muellner, H. Schaefer, R. Lahaye: Evaluation of candidate DNA barcoding loci for economically important timber species of the mahogany family (Meliaceae). In: Molecular Ecology Resources. Band 11, Nr. 3, 2011, S. 450–460. doi:10.1111/j.1755-0998.2011.02984.x.