Als virale Vektoren werden Viruspartikel bezeichnet, die in der Gentechnik dafür verwendet werden, genetisches Material in Zielzellen zu schleusen. Dies können Zellen eines lebenden Organismus oder Zellen einer Zellkultur sein.
Der Transport von DNA in eine Zelle mit Hilfe eines Virus wird als Transduktion bezeichnet, die Zellen, die solche DNA tragen, als transduzierte Zellen. Virale Vektoren (gelegentlich auch als Vektorviren bezeichnet) werden in der Grundlagenforschung und in der Gentherapie verwendet. Auch Impfstoffe auf Basis viraler Vektoren sind bereits im Einsatz. Die Technik der viralen Vektoren wurde erstmals in den 1970er Jahren verwendet und seitdem ständig weiterentwickelt. Virale Vektoren enthalten im Gegensatz zu Virus-like particles (VLP) oder Liposomen mit viralen Membranproteinen (Virosomen) eine zu überbringende Nukleinsäure. Diese Nukleinsäure wird dann entweder vorübergehend abgelesen, bis sie abgebaut wird, oder sie liegt als Episom im Zellkern neben dem Genom vor, oder sie wird dauerhaft in das Genom integriert.
Natürlich vorkommende virale Vektoren sind z. B. die Polydnaviridae.
Eigenschaften Um mit einem viralen Vektor genetisches Material in Zielzellen mittels Transduktion einzubringen, muss zunächst die gewünschte DNA-Sequenz in das Genom der Viren kloniert werden. Dabei werden in den meisten Fällen bestimmte DNA-Bereiche des viralen Genoms ersetzt, so dass die Viren nicht mehr replikationskompetent sind, da ihnen z. B. regulatorische Sequenzen oder die Gene für Enzyme, Kapsid- oder Membranproteine fehlen. Derartige Vektoren können sich nicht mehr selbst vermehren. Infektiöse Partikel können nur dann hergestellt werden, wenn durch eine Komplementation in der Zelllinie, die die Vektoren produziert, entsprechende Informationen z. B. für die fehlenden Proteine und Nukleinsäuren getrennt zur Verfügung gestellt werden. Replikationsdefiziente Vektoren haben den Vorteil, dass sie sich in der Zielzelle, die diese Informationen nicht enthält, nicht vermehren können und werden daher gegenüber unkontrolliert replikationskompetenten Vektoren bevorzugt eingesetzt. Durch homologe Rekombination in der Verpackungszelllinie können allerdings zu einem gewissen Grad wieder replikationskompetente Viren entstehen. Um dies zu vermeiden, wird das genetische Material im Zuge des Vektordesigns häufig derart verändert, dass sie in möglichst vielen Hinsichten replikationsinkompetent sind, z. B. durch mehrfache Deletionen. Werden die genetischen Informationen auf zwei verschiedene Plasmide verteilt, wird von einem Zwei-Plasmid-System gesprochen. Um die Sicherheit der Vektoren weiter zu erhöhen, werden die genetischen Informationen auch auf drei oder mehr verschiedene Plasmide verteilt, die dann zur Vektorherstellung jeweils gemeinsam transfiziert werden müssen.E. Hoffmann, G. Neumann, Y. Kawaoka, G. Hobom, R. G. Webster: A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids. In: Proc Natl Acad Sci USA. Band 97(11), 2000, S. 6108–6113. PMID 10801978; . Neben dem Vektordesign kann auch ein Proteindesign erfolgen. Dies erlaubt die gezielte Anpassung verschiedener Eigenschaften des Transgens und seines exprimierten Proteins.
Kriterien für geeignete virale Vektor sind: Sicherheit und geringe Genotoxizität Geringe Zytotoxizität und Symptomatik Stabilität Zelltypspezifität Größe der genetischen Verpackungskapazität
Während virale Vektoren zur Gentherapie von Gendefekten eine persistente Genexpression erzeugen sollen, werden zur Immunisierung gegen Infektionskrankheiten, zur Phagentherapie von teilweise antibiotikaresistenten Bakterien, zur Behandlung von Tumoren mit onkolytischen Viren oder zur Erzeugung induzierter pluripotenter StammzellenM. Stadtfeld u. a.: Induced Pluripotent Stem Cells Generated Without Viral Integration. science-online, 25. September 2008, doi:10.1126/science.1162494 transiente virale Vektoren eingesetzt. Um einen vorzeitigen Abbau eines viralen Vektors nach Verabreichung zu vermeiden, werden gelegentlich virale Vektoren und ihre Subtypen so ausgewählt, dass möglichst keine präexistierenden und an die Proteine des Virusvektors bindenden Antikörper bestehen.Stefan Kostense, Wouter Koudstaal, Mieke Sprangers, Gerrit Jan Weverling, Germaine Penders, Niels Helmus, Ronald Vogels, Margreet Bakker, Ben Berkhout, Menzo Havenga, Jaap Goudsmit: Adenovirus types 5 and 35 seroprevalence in AIDS risk groups supports type 35 as a vaccine vector. In: AIDS. 18, 2004, S. 1213, .Shawn M. Sumida, Diana M. Truitt, Angelique A. C. Lemckert, Ronald Vogels, Jerome H. H. V. Custers, Marylyn M. Addo, Shahin Lockman, Trevor Peter, Fred W. Peyerl, Michael G. Kishko, Shawn S. Jackson, Darci A. Gorgone, Michelle A. Lifton, Myron Essex, Bruce D. Walker, Jaap Goudsmit, Menzo J. E. Havenga, Dan H. Barouch: Neutralizing Antibodies to Adenovirus Serotype 5 Vaccine Vectors Are Directed Primarily against the Adenovirus Hexon Protein. In: The Journal of Immunology. 174, 2005, S. 7179, .R. Vogels, D. Zuijdgeest, R. van Rijnsoever, E. Hartkoorn, I. Damen, M. P. de Béthune, S. Kostense, G. Penders, N. Helmus, W. Koudstaal, M. Cecchini, A. Wetterwald, M. Sprangers, A. Lemckert, O. Ophorst, B. Koel, M. van Meerendonk, P. Quax, L. Panitti, J. Grimbergen, A. Bout, J. Goudsmit, M. Havenga: Replication-deficient human adenovirus type 35 vectors for gene transfer and vaccination: efficient human cell infection and bypass of preexisting adenovirus immunity. In: Journal of Virology. Band 77, Nummer 15, August 2003, S. 8263–8271, , PMID 12857895, .
Anwendungen Grundlagenforschung
Virale Vektoren wurden ursprünglich als Alternative zu der Transfektion von nackter DNA für molekulargenetische Experimente entwickelt. Verglichen mit traditionellen Methoden wie der Calcium-Phosphat-Transfektion kann durch die Transduktion sichergestellt werden, dass nahezu 100 % der Zellen das genetische Material erhalten, ohne dass die Lebensfähigkeit der Zellen nennenswert eingeschränkt wird. Außerdem sind manche Viren und auch die von ihnen abgeleiteten Viralen Vektoren in der Lage, ihre DNA in das Genom der Zielzelle zu integrieren, so dass die Expression der DNA stabil verankert werden kann und sogar an die Tochterzellen weitervererbt werden kann. Da die Produktion von viralen Vektoren sehr aufwändig ist, sind für viele Anwendungen die sich stetig verbessernden Transfektionstechniken jedoch weiterhin die bessere Lösung.
Gene, die Proteine codieren, können mit Hilfe von viralen Vektoren exprimiert werden, um die Funktion des jeweiligen Proteins zu untersuchen. Vektoren, besonders retrovirale Vektoren, die stabile Markergene wie GFP exprimieren, werden für die permanente Markierung von Zellen eingesetzt, um sie und ihre Nachkommen verfolgen zu können. Dies geschieht beispielsweise bei Xenotransplantationen.
In den Vektor klonierte Gene, die für shRNAs und miRNAs kodieren, können für RNA-Interferenz-Experimente eingesetzt werden.
Gentherapie mini|Gentherapie mit adenoviralen Vektoren Verschiedene gentherapeutische Studien sind bereits seit Beginn der 1990er Jahre durchgeführt worden, bei denen unterschiedliche virale Vektoren zum Einsatz kamen. Mit Hilfe dieser Vektoren soll das defekte Gen, bei einer monogenetischen Erbkrankheit beispielsweise das disfunktionelle ererbte Gen, durch ein gesundes ersetzt werden. Dabei ergeben sich verschiedene Schwierigkeiten, je nachdem, welcher Vektor und welche Methode verwendet wird. In vitro wurden bereits große Fortschritte erzielt, bei der Anwendung im Patienten waren diese jedoch immer von Risiken begleitet, weshalb die Gentherapie noch keine breite Anwendung gefunden hat. Die Immunreaktionen des Patienten gegen den Vektor kann Komplikationen hervorrufen, so im Fall von Jesse Gelsinger, der 1999 mit einem adenoviralen Vektor behandelt wurde. Aus diesen Gründen wird es notwendig sein, für jede Krankheit, die gentherapeutisch behandelt werden soll, einen geeigneten und spezifischen viralen Vektor zu entwickeln.J. C. Pagès, T. Bru: Toolbox for retrovectorologists. In: J Gene Med. Band 6 Suppl 1, 2004, S. S67–S82. PMID 14978752.
Retrovirale Vektoren beispielsweise integrieren ihre Genome in das Genom der Wirtszelle. Dabei geschieht die einzelne Integration an einer zufälligen Stelle im Genom, insgesamt werden jedoch je nach Virustyp bestimmte Stellen wie aktive Gene bei HIV oder Promotorregionen bei MLV stark bevorzugt. An diesen Integrationsorten kann das Virusgenom Gene der Wirtszelle unterbrechen oder natürlicherweise stillgelegte Gene aktivieren, wobei man annimmt, dass dies je nach Integrationsmuster des jeweiligen Virus mehr oder weniger häufig geschieht. Dies kann zur Entartung der Zelle und damit zur Tumorbildung führen, so geschehen in einer Gentherapie-Studie von Severe Combined Immunodeficiency (SCID), die 1999 in Frankreich durchgeführt wurde. Vier der 10 behandelten Kinder entwickelten Leukämien infolge der Behandlung., Pressemitteilung der European Society of Gene Therapy (ESGT) zum vierten Leukämiefall, 18. Januar 2003.
Impfstoffe Transiente Viren, die eine codierende Sequenz von Pathogenen zur transienten Expression tragen, werden derzeit als Impfstoffe gegen Pathogene getestet. Der virale Vektor bringt die DNA oder RNA eines Teils des Pathogens in die Zelle, wo sie exprimiert wird. Ein Impfstoff auf Basis eines viralen Vektors wird als Vektor-Impfstoff bezeichnet. Zugelassene Vektor-Impfstoffe sind cAd3-ZEBOV, VSV-EBOV, AZD1222, Ad26.COV2.S und Sputnik V – alle auf adenoviraler oder VSV-Basis. Bei den zur Impfung verwendeten viralen Vektoren tritt einige Tage nach der ersten Anwendung oftmals eine Vektorimmunität auf, bei der Antikörper gegen Proteine des Vektorvirus gebildet werden, die bei einer späteren erneuten Anwendung zu einem vorzeitigen Abbau des viralen Vektors führen, bevor eine Wirkung entfaltet werden kann.N. Chirmule, W. Xiao, A. Truneh, M. A. Schnell, J. V. Hughes, P. Zoltick, J. M. Wilson: Humoral immunity to adeno-associated virus type 2 vectors following administration to murine and nonhuman primate muscle. In: Journal of Virology. Band 74, Nummer 5, März 2000, S. 2420–2425, , PMID 10666273, .C. S. Peden, C. Burger, N. Muzyczka, R. J. Mandel: Circulating anti-wild-type adeno-associated virus type 2 (AAV2) antibodies inhibit recombinant AAV2 (rAAV2)-mediated, but not rAAV5-mediated, gene transfer in the brain. In: Journal of Virology. Band 78, Nummer 12, Juni 2004, S. 6344–6359, , PMID 15163728, .C. D. Scallan, H. Jiang, T. Liu, S. Patarroyo-White, J. M. Sommer, S. Zhou, L. B. Couto, G. F. Pierce: Human immunoglobulin inhibits liver transduction by AAV vectors at low AAV2 neutralizing titers in SCID mice. In: Blood. Band 107, Nummer 5, März 2006, S. 1810–1817, , PMID 16249376. Daher werden bei erforderlicher mehrfacher Anwendung oftmals Prime-Boost-Ansätze verfolgt, bei der unterschiedliche virale Vektoren, aber die gleichen Transgene verwendet werden.
Geschichte