Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (ausgeschrieben Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus, häufige Kurzschreibweisen sind L. delbrueckii subsp. bulgaricus und L. delbrueckii ssp. bulgaricus) ist ein grampositives, stäbchenförmiges Bakterium, das zur Herstellung von Joghurt verwendet wird. Dabei verstoffwechselt das Bakterium den in der Milch vorhandenen Milchzucker (Lactose) zu Milchsäure (Milchsäuregärung). Dies führt zur Säuerung und Dicklegung der Milch. Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus gehört zu den Milchsäurebakterien, die eine homofermentative Milchsäuregärung durchführen. Er produziert die sogenannte „linksdrehende Milchsäure“. In Molkereien wird er für die Joghurtherstellung meist in Kombination mit Streptococcus salivarius subsp. thermophilus als Starterkultur verwendet. Auch die für den Joghurt typischen Aromastoffe werden durch die beiden Milchsäurebakterien produziert.

Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ist eine Unterart (Subspezies) von Lactobacillus delbrueckii. Vor 1984 war das Bakterium unter dem Namen Lactobacillus bulgaricus bekannt. Der Name geht auf die Entdeckung des Bakteriums in bulgarischem Joghurt zurück. Diese Entdeckung wurde von einigen Autoren dem bulgarischen Wissenschaftler Stamen Grigorow zugeschrieben. Allerdings ist nicht klar, ob er 1905 tatsächlich jenes Bakterium beschrieben hatte, das heute unter dem Namen Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus verstanden wird. Nach heutiger Auffassung wurde das Bakterium erst 1919 durch Sigurd Orla-Jensen unter dem Namen Thermobacterium bulgaricum erstbeschrieben. Der damals von Orla-Jensen untersuchte und beschriebene Bakterienstamm steht als Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ATCC 11842 heute immer noch für Untersuchungszwecke zur Verfügung. Sein Genom wurde im Jahr 2006 vollständig sequenziert. Die Subspezies umfasst noch weitere Bakterienstämme, von denen einige seit langem in der industriellen Joghurtproduktion verwendet werden. Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ist nicht pathogen. Inwiefern er zur Gesundheit des Menschen beiträgt, ist noch nicht abschließend geklärt.

Etymologie Der Gattungsname Lactobacillus (das grammatische Geschlecht ist maskulin) geht auf das Vorkommen und das Aussehen der Bakterienzellen zurück: lac ist lateinisch und bedeutet „Milch“, während bacillus (ebenfalls lateinisch) auf die stäbchenförmige Gestalt hinweist. Das Art-Epitheton delbrueckii wurde zu Ehren des deutschen Bakteriologen Max Delbrück gewählt, während sich bulgaricus, das Epitheton der Unterart, auf die Herkunft der Bakterien aus bulgarischem Joghurt bezieht (siehe auch Taxonomische Geschichte).

Merkmale Erscheinungsbild mini|Kolonien von Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus auf Chinablau-Lactose-Agar, die Bakterien­kolonien sind als Folge der Milchsäure­bildung blau angefärbt. Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus ist ein grampositives, mittellanges bis langes, stäbchenförmiges Bakterium. Eine einzelne Zelle ist 2,0–9,0 Mikrometer (µm) lang und 0,5–0,8 µm breit. Im lichtmikroskopischen Bild finden sich einzelne Zellen, aber auch kurze Ketten von Zellen hintereinander. Das Bakterium besitzt keine Flagellen zur aktiven Bewegung und kann keine Überdauerungsformen wie Endosporen bilden.

In Reinkultur bildet L. delbrueckii subsp. bulgaricus auf festen, Glucose-haltigen Nährböden kreisrunde, farblose bis opak erscheinende Kolonien. In der seitlichen Ansicht erscheinen sie konvex erhaben. Nach Inkubation bei 37 °C über drei Tage erreichen die Kolonien einen Durchmesser von 2 bis 5 mm.

Wachstum und Stoffwechsel Als typische Vertreter der Milchsäurebakterien wachsen Lactobacillen anaerob, aber aerotolerant, d. h., sie wachsen in der Anwesenheit von Luftsauerstoff, benötigen aber keinen Sauerstoff für ihren Stoffwechsel. Dabei sind sie Katalase-negativ und Oxidase-negativ. Sie sind jedoch in der Lage, Cytochrome zu bilden, wenn sie auf Nährböden kultiviert werden, die Hämine oder Blut enthalten. In diesem Fall zeigen sie dann eine positive Reaktion im Oxidase-Test. In Anwesenheit von Sauerstoff werden die beim Abbau von Kohlenhydraten in einer Oxidation frei werdenden Elektronen auf den Sauerstoff (O2) übertragen. Ein mögliches Reaktionsprodukt ist Wasserstoffperoxid (H2O2), das als Zellgift wirkt. Da das häufig für den Abbau von Wasserstoffperoxid verwendete Enzym Katalase nicht von Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus produziert wird, bedient er sich des Enzyms NADH-Peroxidase, um H2O2 zum ungiftigen O2 und Wasser (H2O) zu zersetzen. Weiterhin ist ein für Milchsäurebakterien typisches Kennzeichen der Bedarf an komplexen Wachstumsfaktoren und Aminosäuren bei der Kultivierung. So benötigt L. delbrueckii subsp. bulgaricus unter anderem Riboflavin (Vitamin B2), Niacin (Vitamin B3) und Pantothensäure (Vitamin B5).

Die zur Kultivierung üblicherweise verwendeten Temperaturen liegen im Bereich von 30–40 °C, bei 15 °C oder darunter erfolgt kein Wachstum mehr. Das Bakterium wächst auch noch gut bei 45 °C, das Temperaturoptimum eines untersuchten Stammes liegt bei 42 °C. Somit zählt das Bakterium zu den mesophilen Organismen, mit Tendenz zur Thermophilie. Der optimale pH-Wert für das Wachstum liegt im leicht sauren Milieu, bei pH-Werten 5,2 bis 6,2, wobei auch pH-Werte bis pH 4,0 toleriert werden. Durch die produzierte Milchsäure sinkt der pH-Wert des Nährmediums, sofern keine puffernden Zusätze enthalten sind.

Mit Hilfe der „Bunten Reihe“ werden spezifische Enzyme nachgewiesen, die dem Abbau bestimmter Substrate dienen. Eine bestimmte Kombination von Enzymen ist dabei jeweils typisch für ein bestimmtes Bakterientaxon. L. delbrueckii subsp. bulgaricus zeichnet sich dadurch aus, dass er viele dieser Enzyme nicht bildet. So besitzt er weder Katalase noch Oxidase. Eine Nitratreduktion durch das Enzym Nitratreduktase (NADH) () ist nicht möglich, ebenso wenig der Abbau von Harnstoff durch das Enzym Urease. Außerdem ist das Enzym Arginindihydrolase () nicht vorhanden, so dass keine Abspaltung von Ammoniak aus der Aminosäure Arginin erfolgt. Das Enzym β-Galactosidase ist vorhanden und ermöglicht ihm das Wachstum in Milch unter Verwertung des darin enthaltenen Milchzuckers (Lactose). Er ist nicht in der Lage, Gelatine durch Hydrolyse abzubauen, kann jedoch Casein, ein Protein in der Milch, verwerten. Die dafür notwendigen Proteinasen und Peptidasen werden nicht als Exoenzyme in die Umgebung abgegeben, sondern sind an die Zellwand gebunden.

L. delbrueckii subsp. bulgaricus kann als typisches Milchsäurebakterium durch Fermentation verschiedene Kohlenhydrate zur Energiegewinnung verwerten. Er ist in der Lage, Glucose und Lactose zu verwerten, während die nah verwandte Unterart L. delbrueckii subsp. delbrueckii keine Lactose verwerten kann. Weitere Monosaccharide, die genutzt werden können, sind Fructose, Galactose und Mannose, wobei diese Ergebnisse variabel sind, d. h., sie führen nicht immer zu einem positiven Testergebnis oder unterschiedliche Arbeitsgruppen kommen zu unterschiedlichen Resultaten. So geben einige Quellen an, dass Galactose und Mannose nicht verwertet werden können.

Wegen dieser widersprüchlichen Aussagen, die teilweise auf Untersuchungen basieren, die in den 1970er Jahren durchgeführt wurden, erfolgte 2012 eine erneute Untersuchung, die zeigen sollte, unter welchen Bedingungen welche Kohlenhydrate verwertet werden. Dabei wurde zum einen ein miniaturisiertes Testsystem (API 50 CHL) verwendet, das auf dem Oxidations-Fermentations-Test beruht, bei dem der Abbau eines Kohlenhydrats durch Säurebildung und damit verbunden den Farbumschlag eines pH-Indikators erkannt wird. Als weitere Methode wurde ein Verfahren mit Mikrotiterplatten (AN MicroPlate) eingesetzt, mit dem die Zellatmung kolorimetrisch gemessen wird. Dazu wird der Redox-Indikator Tetrazolium verwendet, der bei Oxidation der Substrate selbst reduziert wird und rot erscheint. Die Untersuchung umfasste 300 Bakterienstämme beim Test auf Säurebildung und 29 Stämme beim Test auf Zellatmung. Die Inkubation erfolgte jeweils anaerob. Allerdings kommen die unterschiedlichen Untersuchungsmethoden teilweise zu unterschiedlichen Ergebnissen. Kein Zweifel besteht daran, dass Glucose, Lactose und Fructose verwertet werden. Für Galactose hingegen zeigt der Test auf Säurebildung bei 25 % der untersuchten Stämme ein positives Ergebnis, während der Test mit dem Redox-Indikator bei den untersuchten Stämmen zu einem negativen Ergebnis führt. Für Mannose zeigt der Test auf Säurebildung bei 25 % der untersuchten Stämme ein positives Ergebnis, während beim Test mit dem Redox-Indikator alle untersuchten Stämme ein positives Ergebnis verursachen. Als mögliche Erklärung wird angegeben, dass die Reduktion des Tetrazoliums direkt den Stoffwechselprozess anzeigt, bei dem ein Substrat oxidiert wird, während bei der Säurebildung mögliche Endprodukte, aber auch Zwischenprodukte, angezeigt werden.

Milchsäuregärung

mini|Strukturformel des D-Lactat-Ions

Kennzeichen einer Fermentation (Gärung) ist, dass die Bakterien zum Abbau der Substrate keinen Sauerstoff benötigen (Anaerobie). Das für Milchsäurebakterien typische und namengebende Endprodukt der Fermentation ist die Milchsäure. Entsprechend wird diese spezielle Form der Fermentation als Milchsäuregärung bezeichnet. Da Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus dabei fast ausschließlich Milchsäure bzw. Lactat (das Anion der Milchsäure) produziert, wird er zu den homofermentativen Lactobacillaceae gerechnet.

mini|hochkant=0.8|Die homofermentative Milchsäuregärung als Übersichtsschema, ausgehend von Glucose. Die erste Kaskade chemischer Reaktionen bei der Milchsäuregärung ist die Glykolyse. Sie umfasst die Umwandlung von Zucker in Energie und Pyruvat. Die Reaktionen werden dabei von Enzymen katalysiert. Welche Zuckerarten verstoffwechselt werden können, hängt somit davon ab, über welche Enzyme ein Bakterium verfügt. Dass Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus das Enzym Aldolase bilden kann, ermöglicht es ihm, Fructose umzusetzen. Das Disaccharid Lactose wird mit Hilfe des Enzyms β-Galactosidase in Glucose und Galactose gespalten. Die Galactose kann anschließend mit Hilfe des Enzyms UDP-Glucose-4-Epimerase in Glucose umgewandelt werden. L. delbrueckii subsp. bulgaricus verfügt zwar über UDP-Glucose-4-Epimerase, allerdings zeigen Untersuchungen, dass Galactose nicht immer verwertet wird.

Bei der eigentlichen Glykolyse wird dann ein Molekül Glucose bzw. Fructose in mehreren Zwischenschritten zu zwei Molekülen Pyruvat abgebaut. Das Pyruvat wird anschließend vom Enzym Lactatdehydrogenase mit dem während der Glykolyse bei der Oxidation von Glycerinaldehydphosphat gebildeten Coenzym NADH zu Lactat reduziert. Das NADH wird dabei zu NAD+ oxidiert. Somit werden aus einem Molekül Glucose zwei Moleküle Milchsäure gebildet. Entsprechend liegt der Energiegewinn bei zwei Molekülen ATP je Molekül Glucose (vergleiche Abbildung).

Die bei L. delbrueckii subsp. bulgaricus vorhandene Lactatdehydrogenase ist stereospezifisch, so dass bei dieser Reaktion zwischen 96,0 und 99,4 % D-(−)-Lactat (Syn.: (R)-Lactat) entstehen. Dieses Enantiomer wird auch als linksdrehende Milchsäure bezeichnet, im Gegensatz zur rechtsdrehenden Milchsäure, dem L-(+)-Lactat (Syn.: (S)-Lactat). Die vereinzelt bei Joghurtprodukten angegebenen Aussagen „mit rechtsdrehender Milchsäure“ oder „mit rechtsdrehenden Kulturen“ beziehen sich auf diese Unterscheidung.