mini|300x300px|Protein mit einem Lysinrest bei physiologischem pH-Wert: unmodifiziert (links) und malonyliert (rechts). Lysinmalonylierung (Kmal, maK), Proteinmalonylierung oder kurz Malonylierung, ist eine reversible posttranslationale Modifikation (PTM) in eukaryotischen und prokaryotischen Zellen, bei der eine Malonylgruppe (–CO–CH2–COOH) an einen Lysinrest (K) eines Proteins angehängt wird. Sie wurde erstmals 2011 durch Peng et al. als evolutionär konservierte Modifikation identifiziert und zählt zu den sauren Acylmodifikationen wie Succinylierung und Glutarylierung. Als dynamisch regulierte Modifikation reagiert sie auf Bedingungen wie Stressreaktionen, Stoffwechselvorgänge und Mutationen und beeinflusst dabei die Ladung, Struktur und Funktion von Proteinen. Dies betrifft unter anderem die Stoffwechselwege von Glukose und Fettsäuren sowie die histonvermittelte Genregulation und wird zunehmend mit Immunregulation, Angiogenese, Arthrose, Krebs und Stoffwechselerkrankungen, wie Adipositas und Typ-2-Diabetes in Verbindung gebracht. Ihre biologische Bedeutung wird zwar zunehmend erkannt, doch viele Aspekte ihrer Regulation und Funktion sind noch ungeklärt, sodass ihr therapeutisches Potenzial bislang unerschlossen ist.
Chemische Eigenschaften Bei physiologischem pH-Wert liegt die ε-Aminogruppe (–NH2) des Lysinrests nahezu vollständig in ihrer protonierten Form (–NH3+) vor, während die Carboxylgruppe (–COOH) der Malonylgruppe nahezu vollständig in ihrer deprotonierten Form (–COO−) vorliegt. Durch die kovalente Bindung einer Malonylgruppe an die ε-Aminogruppe verliert der Lysinrest seine positive Ladung und übernimmt die negative Ladung der Malonylgruppe, was zu einer Ladungsverschiebung von +1 auf −1 führt. Es wird angenommen, dass diese komplette Umkehrung der Ladung ionischen Wechselwirkungen sowohl innerhalb des Proteins selbst als auch mit negativ geladenen Komponenten von Nukleotiden, Proteinen und kleinen Molekülen stört. Solche Veränderungen können an mehreren Lysinresten innerhalb eines einzelnen Proteins auftreten, wobei ihre Häufigkeit im Proteom jedoch stark variiert. In der Mausleber beispielsweise besitzen etwa die Hälfte aller malonylierten Proteine nur eine einzelne Modifikationsstelle, während die Häufigkeit jenseits von vier Stellen stark abnimmt und nur wenige Proteine umfangreich modifiziert sind, wobei das am stärksten modifizierte Enzym die Carbamoyl-Phosphat-Synthetase 1 (CPS1) des Harnstoffzyklus mit insgesamt 31 Stellen ist.
Im Kontext anderer Lysinacylierungen lässt sich die Malonylierung wie folgt einordnen:
Während die Acetylierung die positive Ladung des Lysins neutralisiert, führt die Malonylierung eine negative ein und gehört damit zu den sauren Acylierungen, zu denen auch Methylmalonylierung, Succinylierung, Glutarylierung, 3-Hydroxy-3-methylglutarylierung, 3-Methylglutaconylierung und 3-Methylglutarylierung zählen. Hinsichtlich ihrer Größe ist die Malonylierung (drei Kohlenstoffatome) voluminöser als die Acetylierung (zwei), aber kleiner als die Succinylierung (vier) und die Glutarylierung (fünf). Daraus ergibt sich, dass solche sauren Acylmodifikationen, wie im Fall der Malonylierung und Succinylierung diskutiert, voraussichtlich einen stärkeren Einfluss ausüben als eine Acetylierung an derselben Lysinposition.
Jede Modifikation entsteht aus dem entsprechenden Acyl-CoA-Derivat. Malonyl-CoA wird im Cytosol und in den Mitochondrien durch die Acetyl-CoA-Carboxylase (ACC) gebildet und in den Mitochondrien zusätzlich durch Acyl-CoA-Synthetase-Familienmitglied 3 (ACSF3); Succinyl-CoA stammt aus dem Citratzyklus und dem Aminosäurekatabolismus; Glutaryl-CoA aus dem Aminosäurekatabolismus; und Methylmalonyl-CoA aus dem Aminosäure- und ungeradzahlige Fettsäurestoffwechsel, was sich bei Vitamin-B12-Mangel und Methylmalonazidämien anreichert. Malonyl-CoA ist gegenüber Proteinen weitaus weniger reaktiv als Succinyl-CoA oder Glutaryl-CoA, da seine kürzere Kohlenstoffkette (wie bei Acetyl-CoA) keine intramolekulare Katalyse zur Bildung eines reaktiven, cyclischen Anhydrid-Zwischenprodukts unterstützt, das wiederum eine Modifikation über einen größeren pH-Bereich hinweg ermöglicht. Malonyl-, Succinyl- und Glutarylgruppen werden durch Sirtuin 5 (SIRT5) entfernt, das gegenüber Acetylierungen nur geringe Aktivität zeigt.
Malonylierung findet hauptsächlich in den Mitochondrien statt, tritt jedoch auch im Cytosol und Zellkern auf. In der Mausleber sind etwa 60 % der malonylierten Proteine mitochondrial verortet, während die Verteilung in Fibroblasten vom Menschen gleichmäßiger ist. Auch Succinylierung und Glutarylierung sind in den Mitochondrien angereichert, jedoch nicht ausschließlich auf diese beschränkt. Die relative Häufigkeit dieser Modifikationen spiegelt die Verfügbarkeit der jeweiligen Acyl-CoA-Spender wider: Acetylierung ist am häufigsten, Succinylierung erreicht 10–30 % des Acetylierungsniveaus, Malonylierung tritt mindestens zehnmal seltener auf, und Glutarylierung kommt nur in Spuren vor. Neben ihrer unterschiedlichen Häufigkeit können Malonylierung, Succinylierung und Acetylierung zudem dieselbe Lysinstelle als Ziel haben. In Mitochondrien der Mausleber überlappen sich etwa 85 % der Succinylierungsstellen mit mindestens einer dieser Modifikationen, und rund 6 % können alle drei tragen, hauptsächlich in Proteinen, die an der Fettsäureoxidation, dem Abbau von Glutaryl-CoA und der Ketogenese beteiligt sind. Im Gegensatz dazu überlappen nur 55 % der Malonylierungsstellen mit Succinylierungsstellen, während etwa 45 % einzigartig sind. Diese unterschiedlichen Muster deuten auf eine spezifische regulatorische Rolle der Malonylierung unter den Lysin-Acylmodifikationen hin.+Ausgewählte LysinacylmodifikationenAcetylierungMalonylierungMethylmalonylierungSuccinylierungGlutarylierungFunktionelle GruppeChemische FormelC2H30C3H2O4C4H5O3C4H4O4C5H6O4Vereinfachte Strukturformel–CO–CH3–CO–CH2–COOH–CO–CH(CH3)–COOH–CO–(CH2)2–COOH–CO–(CH2)3–COOHRäumliche AusdehnungZwei KohlenstoffeDrei KohlenstoffeVier KohlenstoffeVier KohlenstoffeFünf KohlenstoffeLadungswechsel +1 → 0 +1 → -1DonorAcetyl-CoAMalonyl-CoAMethylmalonyl-CoASuccinyl-CoAGlutaryl-CoAHäufigkeitAcetyl-CoA < Succinyl-CoA < Malonyl-CoA < Glutaryl-CoANicht-enzymatische Acylierung: ReaktivitätKeine AnhydridringbildungKeine AnhydridringbildungUnbekanntHoch reaktiver fünf-gliedriger AnhydridringHoch reaktiver sechs-gliedriger AnhydridringEnzymatische Deacylierung: Enzyme (Eraser) Zellkern: HDAC1, HDAC2, HDAC3, Sirtuin 1, Sirtuin 2 Cytoplasma: Sirtuin 1, Sirtuin 2 Mitochondrien: Sirtuin 3Global: Sirtuin 5Stoffwechselpfade Nahezu alle Enzyme von Kernstoffwechselpfaden in Verbindung zur Insulin-Sekretion Genregulation Glucosestoffwechsel Fettsäurestoffwechsel Glutaryl-CoA-Abbau Ketogenese Glutathion-Synthese Harnstoffzyklus Arginin-Synthese Oxidoreduktase-Aktivität Oxioreduktase-Aktivität Aminosäurestoffwechsel Fettsäurestoffwechsel Glutaryl-CoA-Abbau Ketogenese Oxioreduktase-Aktivität Aminosäurestoffwechsel Fettsäurestoffwechsel Glutaryl-CoA-Abbau Ketogenese
Malonyl-CoA als Donor
Malonyl-CoA, der Donor für die Lysinmalonylierung, kann Membranen nicht passieren und muss daher in jedem subzellulären Kompartiment lokal synthetisiert werden.
Im Cytosol wird Malonyl-CoA durch die Acetyl-CoA-Carboxylase (ACC) aus Acetyl-CoA und CO2 gebildet und stellt den größten Teil des zellulären Malonyl-CoA-Pools bereit. Die Menge an Malonyl-CoA im Cytosol wird streng reguliert durch das Gegenspiel von ACC und Malonyl-CoA-Decarboxylase (MCD), welches die Rückreaktion katalysiert bei der Acetyl-CoA und CO2 produziert wird. Cytosolisches Malonyl-CoA spielt eine zentrale Rolle in der Regulation des Fettsäurestoffwechsels. Obwohl Malonyl-CoA selbst nicht in die Mitochondrien gelangen kann, kann Malonat, das durch nichtenzymatische Hydrolyse von cytosolischem Malonyl-CoA entsteht, Membranen passieren und zum mitochondrialen Malonyl-CoA-Pool beitragen. In den Mitochondrien wird der Malonyl-CoA-Pool erzeugt durch Acyl-CoA-Synthetase-Familienmitglied 3 (ACSF3), das die Thioesterifizierung von Malonat und CoA katalysiert, und zum anderen durch eine mitochondriale Isoform der Acetyl-CoA-Carboxylase 1 (mtACC1), die Malonyl-CoA durch Carboxylierung von Acetyl-CoA und CO2 erzeugt. Ergänzend dazu wirkt auch MCD in den Mitochondrien, wo es Malonyl-CoA wieder in Acetyl-CoA und CO2 umwandelt. Mitochondriales Malonyl-CoA ist unerlässlich für die lokale Proteinmalonylierung und für die mitochondriale Fettsäuresynthese (mtFAS). Im Zellkern wird Malonyl-CoA durch ACC1 gebildet, das hauptsächlich im Zytoplasma lokalisiert ist, was auf eine lokale und möglicherweise unkonventionelle Funktion hindeutet.
Der Umfang der Malonylierung nimmt mit der Verfügbarkeit von Malonyl-CoA zu, insbesondere unter Bedingungen wie metabolischem Stress oder Enzymdefekten, zum Beispiel bei Malonyl-CoA-Decarboxylase-Mangel.
Mechanismus Nicht-enzymatische Malonylierung Nicht-enzymatische Malonylierung erfolgt spontan durch die direkte Übertragung einer Malonylgruppe von Malonyl-CoA auf die ε-Aminogruppe (–NH2) eines deprotonierten Lysinrests, ohne Beteiligung eines Enzyms. Nur der deprotonierte Lysinrest kann auf diese Weise reagieren, da seine ε-Aminogruppe ein freies Elektronenpaar besitzt, das das Carbonylkohlenstoffatom des hochreaktiven Malonyl-CoA-Thioesters angreifen kann, dessen elektronenziehende Carboxylgruppe seine Reaktivität zusätzlich erhöht. Da der Lysinrest jedoch einen pKa-Wert von etwa 10,5 besitzt, liegt er bei physiologischem pH (~7,4) nahezu vollständig in seiner protonierten Form vor, wobei weniger als 0,1 % – berechnet nach der Henderson-Hasselbalch-Gleichung – deprotoniert vorliegen. Lokale Proteinmikroumgebungen, etwa in der Nähe negativ geladener Reste oder innerhalb hydrophober Taschen, können zusätzlich eine Deprotonierung von Lysin ermöglichen, während allgemeinere Bedingungen wie der alkalischere pH (~8,0) der mitochondrialen Matrix den Anteil deprotonierter Lysinreste auf etwa 0,3 % erhöhen, wodurch die nicht-enzymatische Malonylierung begünstigt wird. In Kompartimenten mit nahezu neutralem pH (~7,2), wie dem Cytosol oder Zellkern, liegen Lysinreste hingegen nahezu vollständig protoniert vor und sind dort stärker die auf enzymatische Malonylierung angewiesen, was darauf hindeutet, dass beide Mechanismen zum Gesamtmalonylierungsmuster in Zellen beitragen.
Enzymatische Malonylierung Bei der enzymatischen Malonylierung können auch protonierte Lysinreste (–NH3+), die bei physiologischem pH (~7,4) nahezu vollständig (≈ 99,9 %) in dieser Form vorliegen, modifiziert werden. Strukturelle Ähnlichkeiten zwischen Acetyl-CoA und Malonyl-CoA deuten darauf hin, dass bestimmte Lysinacetyltransferasen (KATs) möglicherweise auch Malonylierungen katalysieren können. KAT2A (GCN5) wurde experimentell mit der Malonylierung von Histonen in Verbindung gebracht und gilt derzeit als stärkster Kandidat, während auch p300 vorgeschlagen wurde, das zudem für andere Acylmodifikationen wie die Crotonylierung bekannt ist. Analog zum Acetylierungsmechanismus von GCN5 wird angenommen, dass die ε-Aminogruppe vorübergehend durch eine katalytische Base im aktiven Zentrum des Enzyms deprotoniert wird, wodurch dieselbe Reaktion mit Malonyl-CoA ermöglicht wird wie bei der nicht-enzymatischen Malonylierung. Spezifische Enzyme, die als Malonyltransferasen bezeichnet werden können, wurden jedoch bislang nicht eindeutig identifiziert.
Demalonylierung
Die Demalonylierung wird durch das Enzym Sirtuin 5 (SIRT5) katalysiert, eine Histondeacetylase der Klasse III, die für ihre Aktivität NAD+ benötigt, aber durch Nicotinamid gehemmt wird. SIRT5 ist in mitochondrialen, cytoplasmatischen und nukleären Kompartimenten weit verbreitet exprimiert und kann neben Malonylgruppen auch andere negativ geladene Acylmodifikationen entfernen. Es katalysiert die Demalonylierung in folgender Reaktion: