Calcium-Imaging bezeichnet Mikroskopieverfahren, bei denen der Calciumgehalt einer einzelnen Zelle, eines Gewebes oder einer Umgebung optisch gemessen wird. Dafür werden verschiedene Calciumindikatoren eingesetzt, das sind meistens fluoreszente Moleküle, deren Fluoreszenzeigenschaften sich infolge einer chemischen Bindung mit Calciumionen (Ca2+) verändern. Die Calciumindikatoren können in zwei grundlegende Klassen unterteilt werden: synthetische Indikatoren und genetisch codierte Indikatoren (abgekürzt GECI). Indikatoren werden auch danach unterschieden, welche Signalart sie erzeugen. Intensiomerische Indikatoren zeigen die Calciumkonzentration durch eine veränderte Signalintensität bei gleichbleibender Wellenlänge an, wohingegen ratiometrische Indikatoren die Konzentration durch das Verhältnis zwischen zwei verschiedenen Fluoreszenzswellenlängen zeigen. Calciumionen dienen bei eukaryotischen Zellen als sekundärer Botenstoff. Zum Beispiel wird die Bildung von Aktionspotentialen von einem schnellen Calciumeinstrom in die Nerven begleitet. Daher kann Calcium-Imaging genutzt werden, um die elektrische Aktivität hunderter Neuronen in Zellkulturen oder in lebenden Organismen zu überwachen, was ermöglicht, die Aktivität neuronaler Schaltkreise während laufenden Verhaltens zu beobachten.
Synthetische Calciumindikatoren alt=Das Video zeigt die Fluoreszenzintensität von einigen mit Fura-2AM behandelten Nervenzellen. Zunächst sind durch schwache Fluoreszenz mehrere Zellkörper und die diese verbindenden Axone zu erkennen. In einigen Zellkörpern und Axonen steigt die Intensität des Fluoreszenzsignals vorübergehend an. Dies erfolgt nicht überall zeitgleich, sondern es ist erkennbar, dass verschiedene intrazelluläre Kalziumreservoirs entleert werden. Das Video enthält keine Zeitangaben.|mini|Calcium-Imaging zur Visualisierung von Calciumaktivität in Nervenzellen. Die Nervenzellen wurden mit Fura-2AM inkubiert und mit Kaliumchlorid stimuliert, warme Farben signalisieren eine hohe Calciumkonzentration. Bei den synthetischen Indikatoren handelt es sich um kleine Moleküle, welche mit Ca2+ Chelatkomplexe bilden. Diese Moleküle basieren auf Chelatoren wie EGTA oder BAPTA (1,2-bis[o-Aminophenoxy]ethan-N,N,N′,N′-tetraacetat), die eine höhere Affinität mit Calcium- als mit Magnesiumionen aufweisen, und mit fluoreszenten Chromophoren verbunden wurden. Zu diesen Indikatoren gehören Fura-2, Indo-1, Fluo-4 und Calcium-Green-1.
Diese Färbemittel können auf verschiedenen Wegen in die gewünschten Zellen gelangen. Häufig werden die Carboxygruppen des Chelators mit Acetoxymethyl verestert, damit diese lipophil werden und somit leichter durch die Zellmembran ins Zellinnere diffundieren können. (Diese Varianten werden mit der Endung AM im Namen gekennzeichnet.) Dort angekommen, werden die Carboxygruppen durch intrazelluläre Esterasen wieder freigelegt, sodass der Indikator Calciumionen binden kann. Alternativ können die Färbemittel unverändert in die Zellen eingebracht werden. Die Einführung der Indikatoren durch die Zellmembran erfolgt bei diesen Anwendungen etwa mit Patch-Pipetten, in Liposomen oder durch Elektroporation. Durch die Verwendung von Micropipetten oder -elektroden kann dabei gesteuert werden, welches Zellkompartiment den Indikator enthält. Eine weitere Form, in der die Indikatoren eingesetzt werden können, ist gekoppelt an Dextran. Diese müssen, genau wie die unveränderten Indikatoren, invasiv in die Zellen gebracht werden, ermöglichen aber Calcium-Aufnahmen über längere Zeiträume.
Ebenfalls unterscheiden sich die synthetischen Indikatoren in dahingehend, welche Fluoreszenzeigenschaft durch die Bindung mit Calciumionen verändert wird. Bei manchen, intensiometrischen Indikatoren führt die Bindung zu einer gesteigerten Fluoreszenzausbeute bei gleichbleibender Fluoreszenzwellenlänge, wodurch diese gut von anderen, im selben Präparat eingesetzten Fluoreszenzfarbstoffen unterschieden werden können. Bei anderen führt die Bindung zu einer Veränderung der Anregungs- oder Emissionswellenlänge. Die Calciumkonzentration kann dabei ratiometrisch, also aus dem Verhältnis zwischen der Fluoreszenz zweier verschiedener Wellenlängen genau bestimmt werden.
Genetisch codierte Calciumindikatoren Genetisch codierte Calciumindikatoren (englisch: Genetically Encoded Calcium Indicators, abgekürzt GECI) werden eingesetzt, um intrazelluläre Calciumsignale und physiologische Prozesse in lebenden Organismen aufzuzeichnen. Diese müssen nicht durch den Experimentator in die Zellen geladen werden, stattdessen werden sie von den Zellen selbst exprimiert. Das ermöglicht es, gezielt das Calciumsignal von bestimmten Zelltypen oder während bestimmter Entwicklungsstadien zu visualisieren. Dafür werden die Gene, die diese Proteine codieren, mit Transfektionsverfahren in die gewünschten Zellen gebracht, oder es werden transgene Versuchstiere erzeugt, die diese Gene gesteuert durch ausgewählte Promotoren exprimieren. GECIs wurden für die Untersuchung von Neuronen, T-Zellen, Herzmuskelzellen, und anderen Zellarten eingesetzt. Einige dieser Indikatoren emittieren Photonen, wenn sie Calcium binden (Biolumineszenz), aber die meisten Indikatoren enthalten fluoreszente Proteine als Reporter. Dabei handelt es sich oft um das von der Qualle Aequorea victoria natürlich hergestellte grün fluoreszierende Protein (GFP) oder Varianten davon (eGFP, YFP, CFP). Die fluoreszenten Calciumindikatoren können in zwei verschiedene Systeme eingeteilt werden. Das eine besteht aus einem einzelnen, meist zyklisch-permutierten fluoreszenten Protein, das andere aus einem Paar fluoreszenter Proteine, mit denen die Calciumkonzentration ratiometrisch bestimmt wird.
Indikatoren mit einzelnem fluoreszierenden Protein mini|Vorhergesagte Kristallstruktur von GCaMP2 in Bindung mit vier Calciumionen (oben) und ungebunden (unten). Grün: zyklisch permutiertes GFP (cpEGFP), blau: Calmodulin (CaM), lila: M13, orange: Ca2+. Im ungebundenen Zustand konnte die genaue Position von M13 und der Hälfte des Calmodulins nicht vorhergesagt werden, da diese Elemente zu flexibel sind. Zu den ersten entwickelten GECI mit einzelnem fluoreszenten Protein gehören die sogenannten Camgaroos. Dieses Konstrukt nutzt das calciumbindende Protein Calmodulin, welches in die Mitte eines gelb fluoreszierenden Proteins (YFP für yellow fluorescent protein) eingebaut wird. Durch semi-zufällige Mutagenese des Proteins wurde ermittelt, dass das Einfügen neuer Reste an der 145. Position seiner Aminosäurensequenz nicht die Fluoreszenz des YFP beeinträchtigt. Das YFP wird zusätzlich zyklisch permutiert, indem der natürliche N- und C-Terminus des Proteins durch ein kurzes Peptid (GGTGGS) verbunden und anstelle der 145. Aminosäure neue Termini erzeugt werden. Diese werden mit einem Calmodulin fusioniert. Wenn das Calmodulin ein Ca2+-Ion bindet, sinkt der Säuredissoziationswert (pKa) des YFP-Chromophors, sodass er leichter deprotoniert und die Fluoreszenz des YFP somit zunimmt.
Der 2001 entwickelte Indikator GCaMP nutzt ebenfalls ein zyklisch permutiertes GFP, bei dem der natürliche C- und N-Terminus mit einem kurzen Peptid verbunden sind. Der neue C-Terminus ist mit Calmodulin (CaM in der Abbildung) fusioniert, der N-Terminus mit M13 (einer Calmodulin bindenden Domäne der Myosin-leichte-Ketten-Kinase). Das Protein wurde so entwickelt, dass die Termini nahe beieinander liegen und die Bindung mit Ca2+ eine Konformationsänderung hervorruft: das mit Calcium verbundene Calmodulin geht wiederum eine Bindung mit M13 ein, wodurch der in der Mitte des GFP befindliche Chromophor von der wässrigen Umgebung geschützt wird und dadurch die Fluoreszenz des Chromophors zunimmt. GCaMP und darauf basierende Indikatoren haben eine nanomolare Bindungsaffinität.
Einer weiteren Art von Indikatoren mit einzelnem Protein gehört das CatchER an, das allgemein als Indikator mit geringerer Affinität gilt. Es handelt sich um ein EGFP (enhanced GFP) mit einer durch die Einfügung negativ geladener Reste künstlich erzeugten Calciumbindungsstelle. Durch die Bindung mit Ca2+ wird die starke negative Ladung abgeschirmt, sodass die Fluoreszenzinensität wiederhergestellt wird.
Indikatoren aus zwei verschiedenen fluoreszierenden Proteinen mini|Schematische Darstellung einer Cameleonvariante vor der Bindung von Calcium (oben) und nach der Bindung (unten). Durch die Bindung nähern sich das cyan fluoreszierende Protein (CFP) und das gelb fluoreszierende Protein (YFP) an und es kommt zum FRET. Der Prototyp für die Indikatoren aus zwei verschiedenen fluoreszenten Proteinen sind die sogenannten Cameleons. Diese bestehen aus zwei verschiedenfarbigen Proteinen, die zusammen ein Förster-Resonanzenergietransfer-Paar (FRET-Paar) bilden, verbunden durch Calmodulin, M13 und einem Glycylglycinlinker. Solange kein Calcium gebunden ist, fluoresziert nur der FRET-Donor, das blauere der beiden Proteine. Durch die Bindung mit Calcium verbinden sich Calmodulin und M13, sodass das sich der Abstand zwischen den beiden fluoreszenten Proteinen verringert. Dadurch wird die Energieübertragung vom FRET-Donor zum FRET-Akzeptor ermöglicht, der dann langwelligeres Licht emittiert (siehe Skizze). Da die FRET-Effizienz von der vorliegenden Calciumkonzentration abhängt, erzeugen die Cameleons ein ratiometrisches Signal. Die ersten Varianten der Cameleons waren sehr empfindlich für den Säuregehalt der Umgebung, was in folgenden Varianten durch die Einbringung von zwei Mutationen reduziert wurde. GECIJahrCalciumersensorReporterVorgängerCameleons1997CalmodulinFRET-Paar: BFP oder CFP und GFP oder YFP -FIP-CBSM1997CalmodulinFRET-Paar: BFP und RFP -Pericams2000CalmodulincpGFP -GCaMP2000CalmodulincpEGFP -TN-L152004Modifiziertes skelletales Troponin C vom HuhnFRET-Paar: YFP (Citrine) und CFP (Cerulean) -TN-humTnC2004Kardiales Troponin C des MenschenFRET-Paar: YFP (Citrine) und CFP (Cerulean) -TN-XL2006Modifiziertes skelletales Troponin C vom HuhnFRET-Paar: permutiertes YFP (Citrine) und CFP (Cerulean)TN-L15TN-XXL2008Modifiziertes csTnC in TN-XLFRET-Paar: permutiertes YFP (Citrine) und CFP (Cerulean)TN-XLTwitch's2014Troponin CFRET-Paar: zwei verschiedene fluoreszierende Proteine -RCaMP12013CalmodulinmRuby (rot fluoreszierendes Protein) -jRGECO1a2016CalmodulinmApple (rot fluoreszierendes Protein)R-GECO
Nahinfrarot Indikatoren Zunehmende Bedeutung erfahren Nahinfrarot (NIR) GECIs, die ermöglichen, mehrere verschiedenfarbige Indikatoren gleichzeitig im selben Gewebe einzusetzen, und deren Wellenlänge dickere Gewebeschichten durchdringt. Diese Indikatoren basieren nicht auf dem grün fluoreszierenden Protein der Quallen, sondern auf Biliverdin bindenden Proteinen, die größtenteils von bakteriellen Phytochromen abgeleitet sind. Dabei ist die Signalintensität im ungebundenen Zustand am höchsten und nimmt bei Calciumbindung ab. Dadurch besteht die Gefahr, dass sie bei kontinuierlicher Beleuchtung photobleichen. Unter Verwendung zweier verschiedener NIR-fluoreszierender Proteine konnte auch ein NIR Cameleon-Analog entwickelt werden.
Dauerhafte Fluoreszenzmarkierung Eine besondere Klasse von GECIs ist so konzipiert, dass sie eine dauerhaft fluoreszierende Markierung in aktiven Neuronen erzeugt. Sie basiert auf dem photoschaltbaren Protein EosFP der Korallenart Lobophyllia hemprichii. Die Emissionsfarbe dieses Proteins ändert sich bei Bestrahlung mit violettem Licht, durch Spaltungsreaktionen in der Hauptkette, irreversibel von grün zu rot. Der Calciumsensor CaMPARI kombiniert EosFP mit Calmodulin, sodass der Farbwechsel nur bei solchen Neuronen stattfinden kann, die zugleich violett bestrahlt werden und erhöhte Calciumspiegel aufweisen. SynTagMA ist eine synapsenspezifische Variante von CaMPARI2.