mini|Endothelzellen unter dem Fluoreszenzmikroskop. Die Mikrotubuli sind grün (mit FITC-markiertem Antikörper), Aktinfilamente sind rot (mit Phalloidin-TRITC) markiert worden. Die DNA in den Zellkernen wurde mit DAPI angefärbt (blau) Eine histologische Färbung bezeichnet in der Histologie, Pathologie und Zellbiologie eine Färbung von Organellen, Zellen oder Geweben. Sie werden vor allem in der medizinischen Diagnostik und in der Forschung eingesetzt.
Eigenschaften mini|Histologischer Schnitt glatter Muskulatur (HE) Histologische Färbungen dienen der Kontrastverstärkung in biologischen Proben. Dabei werden unterschiedliche Farbstoffe eingesetzt. Teilweise werden ergänzend auch Immunfärbungen und Molekülmarkierungen (wie Fluoreszenzmarkierungen) verwendet. Die Untersuchung erfolgt meist unter einem Lichtmikroskop oder einem Fluoreszenzmikroskop. Es gibt eine Unzahl verschiedener histologischer Färbungen, die im Laufe der letzten 120 Jahre entwickelt wurden. Der Großteil stammt aus den ersten 30 Jahren des vorigen Jahrhunderts. Im modernen Histolabor hat sich eine überschaubare Anzahl an Färbungen durchgesetzt. An erster Stelle steht die Hämatoxylin-Eosin-Färbung (HE-Färbung) als Routine- und Übersichtsfärbung.Leslie P. Gartner, James L. Hiatt: Textbook of histology. 4. Ausgabe, Elsevier, 2017. ISBN 978-0-323-39613-4. S. 2, 3. Dafür werden meist computergesteuerte Färbeautomaten eingesetzt. Daneben werden für bestimmte Fragestellungen sogenannte Spezialfärbungen (meist von Hand) durchgeführt.
Positiv- und Negativfärbung mini|Negativfärbung von Micellen und Liposomen im TEM Färbungen können in zwei Gruppen eingeteilt werden, Positivfärbung und Negativfärbung.G. Clark: Staining Procedures. 4. Auflage, Williams & Wilkins, 1981. ISBN 978-0-683-01707-6. S. 412. Bei der Positivfärbung wird das Objekt des Interesses oder Zielmolekül angefärbt, während bei der Negativfärbung der Hintergrund angefärbt wird und das Objekt von Interesse heller erscheint. Meistens werden in der Diagnostik Positivfärbungen eingesetzt, teilweise auch verschiedene Färbungen nacheinander am selben Präparat (Differentielle Färbung, succedane Färbung),Nina Parker: Microbiology. Rice University, 2016. ISBN 978-1-9471-7-2234. S. 71ff. (freier Volltextzugriff)Gerard J. Tortora (Hrsg.): Microbiology, 11. Auflage, Pearson 2013. ISBN 978-1256-8-5054-0. S. 71. (freier Volltextzugriff) teilweise auch mehrere Färbungen gleichzeitig (Simultane Färbung). Bei der Transmissionselektronenmikroskopie werden dagegen oftmals Negativfärbungen mit Osmiumtetroxid, Rutheniumtetroxid, Wolframatophosphorsäure, Bleicitrat oder Uranylacetat verwendet. Bei einer progressiven Färbung wird so lange gefärbt, bis das gewünschte Ergebnis erreicht wurde und bei einer regressiven Färbung wird überfärbt und anschließend so lange entfärbt, bis das gewünschte Ergebnis erreicht wurde. Eine Gegenfärbung kann zur Kontrastverstärkung verwendet werden.
Bindung der Farbstoffe Die Färbung wird durch Effekte der Diffusion, Elektroadsorption und Grenzflächenadsorption beeinflusst. Die Hauptbindungsart ist die Ionenbindung (saure Farbstoffe werden an basische Proteine gebunden und umgekehrt). Je mehr ionische Gruppen am Farbstoff sind, desto stärker ist im Allgemeinen seine Färbewirkung.Maria Mulisch, Ulrich Welsch: Romeis - Mikroskopische Technik. 19. Auflage, Springer, 2015. . Kapitel 10: Färbungen, S. 172–282. Daneben wirken auch Van-der-Waals-Kräfte, Wasserstoffbrückenbindungen und hydrophobe Effekte. Bei einer Molekülmarkierung wird der Farbstoff meist durch eine kovalente Bindung gebunden. Bei einer Färbung von Lipiden ist eine Bindung zwischen Farbstoff und Zielmolekül nicht immer erforderlich, denn bei einigen Lipidfärbungen reicht es aus, dass sich der Farbstoff in der Lipidphase löst (Diffusionsfarbstoff, z. B. Sudanschwarz-Farbstoffe, Scharlach R, Oil Red O). Daneben werden Präparate zur Lipidfärbung nicht mit organischen Lösungsmitteln behandelt, da sonst die Lipide aus dem Präparat extrahiert würden. Bei manchen Farbstoffen (Beizenfarbstoffe) wird durch Zugabe von manchen Metallsalzen (Aluminium, Eisen, Chrom, Wolfram, Molybdän, Kupfer) als Mordant die Färbewirkung deutlich verstärkt und die Löslichkeit des Farbstoffs gesenkt. Die Bindung der Metallkationen an den Beizenfarbstoff und vermutlich Carboxy- oder Phosphatgruppen am Zielmolekül ist eine Komplexbindung. Dieser Vorgang wird als Beizen bezeichnet und das Produkt als Farblack. Beizen kann vor, während oder nach der Färbung erfolgen, meistens werden Beizen und Färben in einer Lösung durchgeführt.
Metachromasie Manche Farbstoffe ändern ihre Farbe je nach Bindungspartner (Metachromasie), beispielsweise färbt Toluidinblau Gewebe blau und polyanionische Bereiche lila, Acridinorange färbt DNA gelbgrün und RNA rot und Stains-all nimmt unterschiedliche Farben bei polyanionischen Kohlenhydraten, Proteinen (rosa bis blau), DNA (blau) und RNA (blaulila) an.M. R. Green, J. V. Pastewka: The cationic carbocyanine dyes Stains-all DBTC, and Ethyl-Stains-all, DBTC-3,3',9 triethyl. In: The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. Band 27, Nummer 3, März 1979, S. 797–799, PMID 90067.Y. Sharma, C. M. Rao, S. C. Rao, A. G. Krishna, T. Somasundaram, D. Balasubramanian: Binding site conformation dictates the color of the dye stains-all. A study of the binding of this dye to the eye lens proteins crystallins. In: The Journal of biological chemistry. Band 264, Nummer 35, Dezember 1989, S. 20923–20927, PMID 2480348. Metachromatische Effekte können auch bei Änderung des Lösungsmittels (Solvatochromie) oder bei Verwendung von manchen Metallsalzen (Aluminium, Eisen, Chrom, Wolfram, Molybdän, Kupfer) entstehen. So ist beispielsweise Hämatein aus der Hämatoxylinfärbung braunrot, der Eisen-Hämatein-Komplex schwarzblau. Metachromatische Effekte entstehen, wo farbstoffbindende Stellen in großer Anzahl nah beieinander liegen (Abstand ≤ 0,4 nm, z. B. Nukleinsäuren, manche saure Polysaccharide), wodurch viele Farbstoffmoleküle nah beieinander gruppiert und quasi gestapelt orientiert werden. Dadurch bildet sich eine gemeinsame Elektronenwolke der π-Elektronen in den konjugierten Doppelbindungen und das Absorptionsmaximum des Farbstoffs verschiebt sich in den kürzerwelligen Bereich des Lichtspektrums. Die verstärkte Doppelbrechung durch die Metachchromasie von eng gestapelten Farbstoffen wird in der Polarisationsmikroskopie bei der topo-optischen Reaktion nach Georg Romhányi genutzt, um Strukturen zu kontrastieren.
Prinzip Histologie Die Theorie der Färbungen biologischer Proben begründet sich meist in der Reaktionsfähigkeit bestimmter Gewebestrukturen auf bestimmte Farbstoffe. Man klassifiziert die Zellstrukturen und Gewebe anhand des Färbeverhaltens durch die Farbstoffe in basophile, azidophile und neutrophile Strukturen. Basophile Strukturen sind etwa der Zellkern, die Ribosomen und das raue Endoplasmatisches Retikulum, sie enthalten negative Ladungen und färben sich daher mit basischen Farbstoffen mit positiven Ladungen (Hämatoxylin, Eisenhämatoxylin, Azokarmin G, Methylenblau, Toluidinblau) an. Der Nukleus kann durch nukleophile Farbstoffe angefärbt werden. Nukleinsäuren sind polyanionische Biopolymere. Meist sind es basische oder DNA-bindende Farbstoffe, die an Nukleinsäuren binden. Argyrophile Strukturen binden positiv geladene Silberionen, argentaffine Strukturen binden und reduzieren Silberionen zu elementarem Silber. Azidophile Strukturen sind etwa das Zytoplasma und Kollagenfasern. Diese sind leicht basisch und färben sich daher mit sauren Farbstoffen wie Eosin Y, Anilinblau, Pikrinsäure, Säurefuchsin an. Neutrophile Strukturen der Zelle werden weder durch basische noch durch saure Farbstoffe angefärbt. Es sind vorwiegend lipophile Bestandteile.
Histochemie Bei histochemischen Methoden entwickelt sich ein Farbstoff erst durch die Reaktion mit einem Gewebebestandteil (z. B. Berliner-Blau-Reaktion mit Eisenionen, Periodsäure-Schiff-Reaktion bei Kohlenhydraten und Glykosylierungen). Des Weiteren gibt es noch enzymhistochemische Methoden, bei denen die Aktivität zelleigener Enzyme eine Farbentwicklung bewirkt.
Immunhistochemie und Immunfluoreszenz mini|Immunfärbung von β-Amyloid-Ablagerungen im Gehirn bei der Alzheimer-Krankheit Diese klassische Histochemie wird seit den 1980er Jahren durch die Immunhistochemie ergänzt. Dabei werden einzelne Epitope eines bestimmten Proteins per Antigen-Antikörper-Reaktion im Rahmen einer Immunfärbung (mit fluoreszenten Farbstoffen: Immunfluoreszenz) gebunden und nachgewiesen. In einer Mehr-Schritt-Technik wird die Reaktion durch eine Farbreaktion eines Immunkonjugats am Ort des Antigens (meist ein bestimmtes Protein) sichtbar. Typische Herausforderungen bei der Immunhistochemie sind eine unspezifische Färbung, Artefakte aus dem Gewebe, unvollständige Inaktivierung endogener Varianten der Reporterenzyme und Kreuzreaktivität.D. Y. Mebratie, G. G. Dagnaw: Review of immunohistochemistry techniques: Applications, current status, and future perspectives. In: Seminars in diagnostic pathology. Band 41, Nummer 3, Mai 2024, S. 154–160, , PMID 38744555.
Seit den 1990er Jahren findet analog zur Immundetektion von Proteinen die In-situ-Hybridisierung von einzelnen Nukleinsäuren Eingang in die histologische Diagnostik. Hier beruht der Nachweis bestimmter Nukleotidsequenzen auf der Aufschmelzung doppelsträngiger DNA und der spontanen Anlagerung von Einzelsträngen (DNA oder RNA) mit einer Molekülmarkierung. Sind diese Sonden mit Fluorochromen markiert, spricht man von Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH).
Färbung von Lebewesen Ungiftige Farbstoffe können zur Färbung von Strukturen in lebenden Organismen verwendet werden (Intravitalmikroskopie). Neuere Entwicklungen umfassen fluoreszente oder radioisotopenmarkierte Immunfärbungen, die am lebenden Organismus angewendet werden, wie bei der Fluoreszenztomographie. Ein anderer Ansatz der Färbung an Lebewesen ist die Angleichung der Brechungsindices der verschiedenen Phasen in biologischen Geweben, denn der Brechungsindex der wässrigen Phase (Zytosol, Lymphe) beträgt 1,33 und der Brechungsindex der Lipidphase (Biomembrane) beträgt 1,4.Sara Reardon: Slathering mice in a common food dye turns their skin transparent. In: Science 2024, . Der Lebensmittelfarbstoff Tartrazin kann die Brechungsindices angleichen, wodurch tierische Gewebe vorübergehend orange, aber durchsichtig werden.Z. Ou, Y. S. Duh, N. J. Rommelfanger, C. H. Keck, S. Jiang, K. Brinson, S. Zhao, E. L. Schmidt, X. Wu, F. Yang, B. Cai, H. Cui, W. Qi, S. Wu, A. Tantry, R. Roth, J. Ding, X. Chen, J. A. Kaltschmidt, M. L. Brongersma, G. Hong: Achieving optical transparency in live animals with absorbing molecules. In: Science. Band 385, Nummer 6713, September 2024, S. eadm6869, , PMID 39236186.
Ablauf Probenvorbereitung