Bei den Cystobactamiden (CYS) handelt es sich um eine Stoffklasse nicht ribosomal synthetisierter Peptide. Sie wirken als Gyrase- und Topoisomerase-IV-Hemmer (Topoisomerasen vom Typ-II) und stellen durch ihre damit zusammenhängende starke bakteriostatische Wirkung gegen gram-positive und gram-negative Bakterien vielversprechende Kandidaten für zukünftige Breitbandantibiotika dar.
Struktur mini|536x536px|Allgemeine Struktur von Cystobactamiden mit einigen möglichen Substituenten für die variablen Reste. Das Westfragment (rot) und das Ostfragment (grün) sind über einen Linker (blau), hier α-methoxy-L-Isoasparagine, verknüpft. Generell lassen sich Cystobactamide in drei Fragmente unterteilen, deren Konstitution höchst ungewöhnlich ist. Sie bestehen aus einem Ost- und einem West-Fragment, welche von dem dritten Fragment, dem Linker, miteinander verknüpft werden. Durch Besonderheiten in der Biosynthese können allerdings auch Cystobactamide entstehen, die lediglich aus einem Ostfragment bestehen.Dr. Elgaher, W. A. M., Dr. Hamed, M. M., Dr. Baumann, S., Dr. Herrmann, J., Siebenbürger, L., Krull, J., Cirnski, K., Prof. Dr. Kirschning, A., Prof. Dr. Brönstrup, M., Prof. Dr. Müller, R., & Prof. Dr. Hartmann, R. W.: Cystobactamid 507: Concise Synthesis, Mode of Action, and Optimization toward More Potent Antibiotics, Chemistry – A European Journal, Volume 26 Issue 32, 26. Januar 2020, Seite 7219–7225
Ost- und Westfragment Die Ost- und West-Fragmente setzten sich aus den in Sekundärmetaboliten äußerst selten auftretenden p-ABA-Derivaten zusammen. Das Ost-Fragment besteht immer aus einem p-ABA (p-ABA-2) und einem p-NBA (p-Nitrobenzoesäure; p-NBA-1). Diese sind über eine Peptidbindung der Amino-Gruppe des p-ABA-2 und der Säuregruppe des p-NBA-1 miteinander verknüpft. Das Ostfragment bindet an den Linker mit einer Peptidbindung über die Säuregruppe des p-ABA-2. Das Westfragment setzt sich aus drei p-ABA-Derivaten zusammen, welche, wie das Ostfragment, untereinander und auch mit dem Linker über Peptidbindungen verknüpft sind. Die p-ABA-3 Einheit weist neben einem variablen Rest in meta-Position auch ein Hydroxygruppe in Orthoposition auf. Die p-ABA-5 Einheit kann weiterhin sowohl an der ortho-, als auch meta-Position variable Reste tragen.
Linker Als Linker treten verschiedene Moleküle in Erscheinung, von denen einige als Bausteine in Biomolekülen einzigartig sind, wie zum Beispiel α-Methoxy-L-isoasparagin. Insgesamt wurden in natürlichen Cystobactamiden neben α-Methoxy-L-isoasparagin auch β-Methoxy-L-asparagin, β-Cyano-L-alanin, β-Methoxy-L-aspartat und α-Methoxy-L-isoaspartat beobachtet. All diese natürlich auftretenden Linker-Einheiten werden ausgehend von L-Asparagin gebildet.
Biologische Wirkung Ein häufiges Problem bei der Behandlung von verschiedenen Bakterien mit Antibiotika sind potentielle Nebenwirkungen und die beschränkte Anwendbarkeit auf verschiedene Arten. Besonders gram-negative Bakterien, zu denen die multiresistenten Erreger der sogenannten ESKAPE-Gruppe gehören, stellen die Medizin und Pharmazie vor große Probleme. Grund hierfür ist, dass gram-negative Bakterien durch ihren Aufbau zusätzliche Hürden in der Behandlung aufweisen. Anders als gram-positive Bakterien, deren Zelle durch eine Membran und eine dicke Mureinschicht begrenzt wird, haben gram-negative Bakterien zusätzlich zur Zellmembran und einer sehr viel dünneren Mureinschicht eine Zellwand, die als äußerste Begrenzung dient. In diese sind Lipopolysaccharide gebettet, welche Endotoxine beinhalten und bei Freisetzung eine toxische Wirkung auf den menschlichen Körper haben können. Außerdem erschwert die äußere Zellwand den Transport eines Antibiotikums in das Bakterium.Baumann, S., Herrmann, J., Raju, R., Steinmetz, H., Mohr, K. I., Hüttel, S., Harmrolfs, K., Stadler, M. & Müller, R.: Cystobactamids: Myxobacterial Topoisomerase Inhibitors Exhibiting Potent Antibacterial Activity, Angewandte Chemie Int. Ed. 2014, 53, Seite 14605–14609.Kolter T.: Cystobactamide, RD-03-04650 (2019) in Böckler F., Dill B., Eisenbrand G., Faupel F., Fugmann B., Gamse T., Matissek R., Pohnert G., Rühling A., Schmidt S., Sprenger G., RÖMPP [Online], Stuttgart, Georg Thieme Verlag, Januar 2023.Salton, Milton R.J.: “Structure.” Medical Microbiology. 4th Edition., U.S. National Library of Medicine, 1. Januar 1996.
Im Wesentlichen gibt es zwei mögliche Wirkungsansätze für Antibiotika. Sie können die Bakterienzelle entweder zerstören (bakterizid) oder den Reproduktionsprozess oder das Wachstum des Erregers behindern (bakteriostatisch). Bei einem bakteriziden Antibiotikum werden durch die Zerstörung der Zellmembranen die Lipopolysaccharide freigesetzt und lösen Entzündungsreaktionen aus. Neben leichteren Immunantworten auf die Endotoxine wie Fieber und Blutdruckabfall können die bei der Behandlung stärkerer Infektionen freiwerdenden Mengen zu einer Überreaktion des Immunsystems führen und zum Beispiel eine Sepsis nach sich ziehen.
Wirkmechanismus Cystobactamide wirken bakteriostatisch, was bedeutet, dass sie in den Reproduktionsprozess der Bakterien eingreifen. Sie hemmen die Gyrase und Topoisomerase-IV, welche beide zu den Topoisomerasen vom Typ-II gehören und deren Funktionsmechanismus entsprechend ähnlich ist. Topoisomerasen des Typs-II sind in der Lage, Doppelstrangbrüche in der DNA zu erzeugen und diese im Anschluss wieder zu reparieren. Die Topoisomerase-IV macht sich dies bei der Dekatenierung der miteinander verlinkten zirkulären DNA-Tochterstränge am Ende der DNA-Replikation eines Bakteriums zu Nutze. Dabei schneidet sie zunächst einen der Stränge, um eine Trennung zu ermöglichen und repariert diesen Schnitt im Anschluss wieder. Die Funktion der Gyrase ist das negative supercoiling von DNA. Eine ihrer Aufgaben ist dabei das Verdrehen des DNA-Strangs in negative Richtung vor der Replikationsgabel, um die rechtsgewundene DNA zu entwinden und sie so zugänglich für die Enzyme zu machen, die für die Replikation verantwortlich sind. Beide Topoisomerasen verbrauchen bei ihren jeweiligen Prozessen ATP.Schoeffler, A. J., & Berger, J. M.: Q. Rev. Biophys., 41, 2008, S. 41–101.
Theoretisch gibt es also zwei Möglichkeiten, die Aktivität der Gyrase und Topoisomerase-IV einzuschränken. Entweder kann die ATP-Bindungsstelle blockiert oder der DNA-Gyrase-Komplex stabilisiert werden. Durch Untersuchungen konnte nachgewiesen werden, dass Cystobactamide durch die Stabilisierung des Gyr-A-tyrosyl-DNA-Komplexes wirken und unabhängig von der Menge an vorhandenem ATP gleich wirkungsvoll sind. Konkret funktionieren Cystobactamide durch minor-groove Bindung an die DNA. Interessant ist auch, dass die Bindung keine Interkalation zeigt und außerdem sehr spezifisch ist. Interessant ist dies, weil die Cystobactamide so zu einer der wenigen Stoffklassen gehören, die spezifisch nur an die minor groove binden.
Vergleich mit Ciprofloxacin Ein Antibiotikum, welches sehr häufig für den Vergleich bei der Untersuchung der Wirksamkeit der Cystobactamide herangezogen wird, ist Ciprofloxacin. Auch bei Ciprofloxacin handelt es sich um einen Gyrase-Hemmer, deren Zielstruktur auf der DNA sich jedoch unterscheidet. Die beiden potentesten bekannten Derivate sind Cys 861-2 und Cys 919-2. In Studien wurden die Mindest-Hemm-Konzentrationen (MHK), die Werte für den IC50 und die Nebeneffekte der beiden Cystobactamid-Derivate mit denen von Ciprofloxacin verglichen. Gegen einige gram-positive Erreger wurde eine höhere Wirksamkeit im Vergleich zu Ciprofloxacin festgestellt. Die Wirksamkeit gegenüber gram-negativen Erregern hingegen ist vergleichbar mit der von Ciprofloxacin, jedoch geringer als die Wirksamkeit des verwandten Naturstoffs Albicidin, dessen Werte für den IC50 niedriger sind. Gegen vereinzelte Stämme gram-negativer Bakterien konnte sogar eine höhere Wirksamkeit des Cys 861-2 festgestellt werden. Auch eine Hemmung der Gyrase-Aktivität bei Ciprofloxacin-resistenten Stämmen konnte verzeichnet werden.B. Cheng, R. Müller, D. Trauner: Angew. Chem. Int. Ed. 2017, 56, S. 12755–12759.W. B. Graninger, W. Graninger, R. Ullrich, M. Köller, L. Erlacher: Effects of ciprofloxacin and ofloxacin on adult human cartilage in vitro. In: Antimicrobial Agents and Chemotherapy. Band 41, Nr. 11, 1. November 1997, S. 2562–2565. +Vergleich der MHK- und IC50-Werte für P. aeruginosaCys 919-2Cys 861-2CiprofloxacinAlbicidinMHK [µg·mL−1]>6413,2IC50 [µM]0,340,180,480,04 Besonders auffällig ist, dass die MHK-Werte der beiden Cystobactamid-Derivate in-vitro vergleichbar sind, während Cys 919-2 in-vivo einen gravierenden Aktivitätsverlust erleidet. Die Gründe hierfür sind noch nicht abschließend geklärt, jedoch ist davon auszugehen, dass der Aktivitätsverlust während des Transports in die Zellen stattfindet. Im Gegensatz zu Cys 861-2, das erst ab einer Konzentration von 100 µM zytotoxische Effekte aufweist, treten diese bei Ciprofloxacin bereits im einstelligen µM-Bereich auf.
Weiterhin konnte festgestellt werden, dass Cys 861-2 eine geringe Stabilität im periplasmatischen Raum und geringe Löslichkeit in Phosphatpuffern aufweist. Dies müsste durch Derivatisierung umgangen werden, um einen Aktivitätsverlust zu vermeiden. Die geringe Stabilität ist durch die basenlabile Amidbindung zu erklären. Ein vielversprechendes Derivat des Cys 861-2 weist an dessen A-Ring eine Nitrilgruppe auf. Es zeigt eine höhere Stabilität gegenüber Basen und liefert vergleichbare Aktivität, die zum Teil auch gegen einen Cys-861-2-resistenten Stamm verzeichnet werden konnte. Allerdings handelt es sich dabei bislang nur um erste Erkenntnisse der Forschung.
Biosynthese Die Synthese von Cystobactamiden geschieht über sogenannte nicht ribosomale Peptid Syntheasen (NRPS). Das sind große Enzymkomplexe, die eine multimodale Struktur aufweisen. Jedes dieser Module ist weiter unterteilt in voneinander unabhängig agierende Domänen, wobei jede Domäne in der Regel eine spezifische Reaktion katalysiert. NRPS Biosynthesen sind nicht auf die Verwendung von proteinogenen Aminosäuren angewiesen, was eine große Variabilität für die Synthese von chemischen Grundgerüsten ermöglicht.
Die potentesten Vertreter der Cystobactamide sind Hexapeptide. Für deren Synthese werden entsprechend sechs Module benötigt, die über ihre jeweiligen Domänen den Einbau des Linkers oder p-ABA-Einheiten katalysieren. Für die Zusammensetzung der Peptidkette werden hauptsächlich drei verschiedene Arten von Domänen verwendet, die mit „A“, „T“ und „C“ bezeichnet werden. „A“ steht dabei für Adenylierungsdomäne. Sie aktivieren die Aminosäuren unter Verwendung von ATP. „T“ sind Thiolierungsdomänen. Sie sind verantwortlich für das Binden der aktivierten Aminosäuren sowie der wachsenden Peptidkette. „C“ bezeichnet Kondensierungsdomänen, die die Ausbildung von Peptidbindungen katalysieren.
Die verschiedenen natürlich vorkommenden Cystobactamide unterscheiden sich in ihrem Linker und den p-ABA-Derivaten, die über die letzten beiden Module in die Peptidkette eingefügt werden. Im Gegensatz zu der ersten p-ABA-Einheit, die während oder nach Ende des Kettenwachstums von p-ABA zu p-NBA umgewandelt wird, müssen die über das fünfte und sechste Modul eingefügten p-ABA-Derivate bereits vor ihrem Einbau in die Kette synthetisiert werden. Dasselbe gilt für die Linker. Alle bisher bekannten natürlich vorkommenden Linker können ausgehend von CysH aktiviertem L-Asparagin über enzymatische Umsetzungen hergestellt werden. Die fertigen Linker werden über CysB zum dritten Modul am CysK transportiert, das deren Einbau in die Peptidkette katalysiert.Baumann, S., Herrmann, J., Raju, R., Steinmetz, H., Mohr, K. I., Hüttel, S., Harmrolfs, K., Stadler, M. & Müller, R.: Cystobactamids: Myxobacterial Topoisomerase Inhibitors Exhibiting Potent Antibacterial Activity, Supporting Information, Angewandte Chemie Int. Ed. 2014, 53.