mini|Struktur von Ub-AMC Ubiquitin-7-amino-4-methylcumarin oder Ub-AMC ist ein fluoreszent markiertes Protein,L. C. Dang, F. D. Melandri, R. L. Stein: Kinetic and mechanistic studies on the hydrolysis of ubiquitin C-terminal 7-amido-4-methylcoumarin by deubiquitinating enzymes. In: Biochemistry. Band 37, Nummer 7, Februar 1998, S. 1868–1879, , PMID 9485312. das in der biochemischen Forschung zur Messung der Aktivität von bestimmten Enzymen aus der Gruppe der desubiquitinierenden Enzyme (DUB) und Ubiquitin-spezifischen Proteasen (USP) verwendet wird.
Eigenschaften Ubiquitin wird in Zellen an Proteine angehängt, die im Proteasom abgebaut werden sollen. Während ubiquitinierende Enzyme die Verbindung von Ubiquitin mit anderen Proteinen katalysieren, bewirken die desubiquitinierenden Enzyme, dass diese Verbindung wieder getrennt wird. Ub-AMC wird durch Desubiquitinasen in Ubiquitin und den Fluoreszenzfarbstoff AMC gespalten.
Ub-AMC besteht aus Ubiquitin, das am C-Terminus mit dem Fluoreszenzfarbstoff 7-Amino-4-methylcumarin (AMC) derivatisiert wird. Dabei wird die freie Carboxygruppe des Proteins mit der Aminogruppe des Farbstoffs zu einem Carbonsäureamid umgesetzt. Durch die desubiquitinierenden Enzyme wird der Farbstoff vom Enzymsubstrat abgespalten und beginnt stärker zu fluoreszieren. Der Anstieg der Fluoreszenz (Anregung 345 nm, Emission 445 nm) kann gemessen werden und die Enzymaktivität lässt sich somit kontinuierlich verfolgen.
Verwendung Ub-AMC wird parallel zu Interferon-stimulated gene product 15-AMC und Nedd8-AMC zur Proteincharakterisierung von Desubiquitinasen verwendet.H. A. Lindner, V. Lytvyn, H. Qi, P. Lachance, E. Ziomek, R. Ménard: Selectivity in ISG15 and ubiquitin recognition by the SARS coronavirus papain-like protease. In: Archives of biochemistry and biophysics. Band 466, Nummer 1, Oktober 2007, S. 8–14, , PMID 17692280, . Alternativ kann teilweise Z-LRGG-AMC verwendet werden, das AMC-gekoppelte Ubiquitin-Sequenzmotiv.W. Rut, M. Zmudzinski, S. J. Snipas, M. Bekes, T. T. Huang, M. Drag: Engineered unnatural ubiquitin for optimal detection of deubiquitinating enzymes. In: Chemical science. Band 11, Nummer 23, Juni 2020, S. 6058–6069, , PMID 32953009, . Zur Bestimmung der Dissoziationskonstante von Desubiquitinasen kann ein kompetitiver Assay mit Ub-AMC verwendet werden.M. T. Morgan, C. Wolberger: Competition Assay for Measuring Deubiquitinating Enzyme Substrate Affinity. In: Methods in molecular biology. Band 1844, 2018, S. 59–70, , PMID 30242703, . Ub-AMC wird auch zur Messung der Aktivität der Protease OTU des Krim-Kongo-Hämorrhagisches-Fieber-Virus verwendet.F. Kocabas, G. S. Aslan: Fluorometric CCHFV OTU protease assay with potent inhibitors. In: Virus genes. Band 51, Nummer 2, Oktober 2015, S. 190–197, , PMID 26156848.
Einzelnachweise
Kategorie:Fluorophor Kategorie:Peptid