mini|Ein Glühwürmchen der Art Lampyris noctiluca, das durch eine biochemische Reaktion mit Hilfe eines artspezifischen Luciferins Licht erzeugt.
Luciferine (abgeleitet von ) sind unterschiedliche Naturstoffe, die in verschiedenen biolumineszenten Organismen zur Erzeugung von Licht genutzt werden. Durch katalytische Aktivität des entsprechenden Luciferase-Enzyms reagieren sie mit Sauerstoff (Oxidation). Bei der Veränderung, meistens der Abspaltung von Teilgruppen an dem Luciferin, wird Energie in Form von Licht abgegeben. Sowohl Luciferine als auch Luciferasen sind art- oder taxonspezifisch, also für jede Lebewesengruppe kennzeichnend.
Geschichte Schon im 17. Jahrhundert beobachtete Robert Boyle, dass jedes biolumineszente System Sauerstoff benötigt.
Zu Beginn des 18. Jahrhunderts beobachtete René Réaumur, dass Pulver getrockneter und gemahlener biolumineszierender Organismen bei Zugabe von Wasser leuchten. Die ersten Berichte von experimentellen Arbeiten mit Luciferin-Luciferase-Systemen gehen auf den Franzosen Raphael Dubois zurück. Er entdeckte 1885 bei Arbeiten an Leuchtkäfern, dass ein Stoff in einer lichtgebenden Reaktion verbraucht wird. Dabei extrahierte er aus verschiedenen Organismen, die biologisches Licht erzeugen, Stoffe, die Ursache für das Leuchten sind und durch Hitze nicht zerstört werden, und er bezeichnete sie als Luciferin. Eine weitere für das Leuchten erforderliche Komponente, die hitzelabil ist, bezeichnete er als Luciferase. Heutzutage weiß man, dass eine taxon-spezifische Luciferase das Enzym ist, das das dazugehörende ebenfalls taxon-spezifische Luciferin umsetzt. Beim Mischen von Luciferin mit Luciferase in Gegenwart von Sauerstoff konnte Dubois die natürliche Biolumineszenz imitieren.
Die nächsten Untersuchungen wurden von Edmund Newton Harvey Anfang des 20. Jahrhunderts durchgeführt.E. N. Harvey: Bioluminescence. Academic, New York 1952. Er fand heraus, dass es in jedem Luciferin-Luciferase-System eine Spezifität gibt. So können Luciferine der einen Spezies nicht durch die Luciferase einer anderen Spezies umgesetzt werden. Große Fortschritte in der Strukturaufklärung wurden ab den 1950er Jahren durch den Nobelpreisträger Osamu Shimomura erzielt.
Eigenschaften Biolumineszente Systeme sind nicht evolutionär konserviert, die Luciferasen teilen keine Sequenzhomologie. Luciferasen treten aber in 17 unterschiedlichen Stämmen und mindestens 700 meist marinen Gattungen auf.J. W. Hastings: Bioluminescence. In: N. Sperelakis (Hrsg.): Cell Physiology, 3. Auflage, Academic Press, New York 2001, S. 1115–1131. Offenbar wurden sie oft „erfunden“, phylogenetische Studien wiesen darauf hin, dass Luciferin-Luciferase-Systeme mehr als 30 unabhängige Ursprünge besitzen.P. J. Herring: Systematic distribution of bioluminescence in living organisms. In: J Biolumin Chemilumin., Band 1, Nr. 3, 1987, S. 147–163, PMID 3503524. Die Spannweite der emittierten Farbe befindet sich zwischen blauem und rotem Licht (400 bis 700 nm), wobei Blautöne am häufigsten vorkommen, während rote Farben selten beobachtet werden. Dies erklärt sich damit, dass die meisten biolumineszenten Organismen im Meer vorkommen und blaues Licht das Wasser am weitesten durchdringt.
Definition Laut klassischer Definition ist das an der Luciferase gebundene Luciferin der Lichtemitter. Die Luciferase setzt unter Verbrauch von Sauerstoff das Luciferin hierbei um, manchmal werden dafür auch Cofaktoren wie ATP oder Ionen benötigt. Das oxidierte Luciferin befindet sich zunächst in einem Übergangszustand I und gelangt dann – häufig nach Decarboxylierung und weiteren Zwischenschritten – in einen elektronisch angeregten Zustand P*. Dieser fällt nach recht kurzer Zeit (wenige Nanosekunden) zurück in seinen Grundzustand P und emittiert währenddessen ein Lichtquant. Normalerweise sind die umgesetzten Luciferine auch Fluorophore, da sie durch Bestrahlen von Licht in einen angeregten Zustand gelangen können.
mini|hochkant=2|ohne|Luciferine (L) werden durch Luciferasen unter Verbrauch von Sauerstoff umgesetzt, dabei entsteht über ein Zwischenschritt I letztlich ein Molekül in einem elektronisch angeregten Zustand P*. Nach einer kurzen Lebenszeit wird ein Photon emittiert und der Grundzustand P erreicht.
Prinzipien Um in den angeregten Zustand P* zu gelangen, ist biochemisch gesehen viel Energie nötig. Die Emission von Photonen mit einer Wellenlänge von 500 nm (grün, Energie etwa 2 eV/Photon) benötigt etwa 250 kJ/mol – zum Vergleich: die Hydrolyse von ATP zu ADP und Phosphat setzt etwa 30 kJ/mol frei. Außerdem kann die Energie nur in einem Schritt freigesetzt werden. Die Energie wird vom molekularen Sauerstoff geliefert, wenn seine relativ schwache Doppelbindung gebrochen und eine stärkere Bindung (z. B. in CO2, 300 kJ/mol stabiler) gebildet wird.
Das häufigste Prinzip ist die Bildung eines Vierrings, eines Dioxetan bzw. Dioxetanon (α-Peroxylacton, entdeckt von dem 1937 geborenen Chemiker Waldemar AdamWalter Habel (Hrsg.): Wer ist wer? Das deutsche Who’s who. 24. Ausgabe. Schmidt-Römhild, Lübeck 1985, ISBN 3-7950-2005-0, S. 4.). Nach erfolgter Decarboxylierung bildet sich der elektronisch angeregte Zustand.
mini|hochkant=2|ohne|Ein Dioxetanon ist instabil und zerfällt unter Abspaltung von CO2. Dies erzeugt ein Keton in einem elektronisch angeregten Zustand.
Manchmal entspricht die Fluoreszenz nicht der erwarteten, zum Beispiel bei Studien in vitro (im Reagenzglas). Dafür gibt es verschiedene Ursachen. So emittieren an Enzyme gebundene Luciferine bei Oxidation anders als freie Luciferine nach Anregung durch Licht. Manchmal wird die Energie an einen zweiten Fluorophor übertragen, so wie es beispielsweise bei Aequorin zu GFP in Aequorea victoria geschieht.
Quantenausbeute Ob die Umsetzung eines Luciferins durch die korrespondierende Luciferase effizient ist, wird durch die Quantenausbeute bestimmt. Die Quantenausbeute ist die Anzahl der emittierten Lichtquanten je umgesetztem Molekül Luciferin.Emil H. White, Eliezer Rapaport, Howard H. Seliger, Thomas A. Hopkins: The chemi- and bioluminescence of firefly luciferin: an efficient chemical production of electronically excited states. In: Bioorg. Chem., Band 1, Nr. 1–2, September 1971, S. 92–122, doi:10.1016/0045-2068(71)90009-5. Eine Quantenausbeute von 1 würde bedeuten, dass bei jedem umgesetzten Molekül Luciferin ein Lichtquant frei wird. Die bislang höchste Quantenausbeute Q wurde für das Leuchtkäferluciferin aus Photinus pyralis mit Q = 0,41 nachgewiesen.
Luciferin-Typen Luciferin-Luciferase-Systeme kommen in zahlreichen Arten vor. Es gibt vier Hauptklassen an Luciferin-Luciferase-Systeme, bei denen das Luciferin nach Umsetzung durch eine Luciferase in einen elektronisch angeregten Zustand überführt und damit der eigentliche Lichtemitter wird.
Das Firefly-Luciferin, ein Benzothiazolen mini|hochkant|Ein Glühwürmchen der Art Lampyris noctiluca mini|hochkant|links|Photinus pyralis im Flug
Biolumineszente Insekten sind in den vier Ordnungen Collembola, Hemiptera, Coleoptera sowie Diptera vertreten. Jedoch wurden nur die Biolumineszenzsysteme aus Organismen der beiden letztgenannten Ordnungen untersucht. Bei Coleoptera (Käfer) können Vertreter aus drei Familien Licht erzeugen: Phengodidae (Federleuchtkäfer), Elateridae (Schnellkäfer) sowie Lampyridae (Leuchtkäfer).
Der amerikanische Leuchtkäfer Photinus pyralis () gehört zur Familie der Lampyridae. Er wurde bereits von Dubois zu seinen Studien über Luciferine-Luciferasen (vgl. oben) herangezogen. Wissenschaftliche erste Untersuchungen der Biolumineszenzreaktion bei P. pyralis wurden 1917 durch Harvey eingeleitet. Inzwischen ist dieses Luciferin-Luciferase-System das am besten untersuchte und wird im Folgenden vorgestellt.
Biolumineszenzreaktion mini|hochkant|links|Strukturformel von D-Luciferin aus Leuchtkäfern der Art Photinus pyralis. Es wird im Folgenden auch als LH2 abgekürzt.
Für die Reaktion setzt eine Luciferase das Substrat D-Luciferin (LH2), ein Benzothiazol, unter Verbrauch von Sauerstoff (O2) um. Die Arbeiten von William D. McElroy Ende der 1940er Jahre haben gezeigt, dass für die Reaktion ATP und Magnesiumionen als Cofaktoren benötigt werden:
Das ATP wird dabei zu AMP und Pyrophosphat (PPi) umgesetzt und ein Lichtquant (hν) abgegeben.
Im Vergleich zu Luciferinen anderer Systeme (siehe unten) ist das Luciferin aus Leuchtkäfern eine relativ stabile Verbindung. Der Schmelzpunkt liegt bei 205–210 °C. Sein molarer Extinktionskoeffizient bei 328 nm beträgt ε = 18.200 M−1·cm−1. Dieses Luciferin fluoresziert und zeigt ein Emissionsmaximum bei λmax = 537 nm.
Die Luciferase () der Leuchtkäfer hat eine Molekularmasse von ca. 60–62 kDa, bei P. pyralis genau 61 kDa, und ist aus 550 Aminosäuren aufgebaut. Sie katalysiert die oxidative Decarboxylierung von Luciferin zu Oxyluciferin (oxy-L, vgl. auch untenstehende Abbildung, Kasten). Die Reaktion läuft in den Peroxisomen der Lichtorganzellen ab.G. A. Keller, S. Gould, M. Deluca, S. Subramani: Firefly luciferase is targeted to peroxisomes in mammalian cells. In: Proc Natl Acad Sci USA, Band 84, Nr. 10, Mai 1987, S. 3264–3268, . Die Struktur der Luciferase aus P. pyralis wurde erstmals 1956 mit einer Auflösung von 200 pm dargestellt. Für diese Analyse wurden große Mengen an Leuchtkäfern durch hilfsbereite Kinder gesammelt, die für jedes abgelieferte Exemplar einen Cent Belohnung erhalten hatten.
Ohne gebundenes Substrat liegt die Luciferase in einer offenen Konformation vor; ein großer N-terminaler und ein kleiner C-terminaler Bereich bilden eine tiefe Furche. Bei Substratbindung führt eine Konformationsänderung zum Schließen der Furche. Mitte der 1980er Jahre konnte Luciferase erfolgreich in das Genom des Bakteriums E. coli eingebaut und dort exprimiert werden. Luciferasen aus Leuchtkäfern der Familie Lampyridae sind sehr ähnlich aufgebaut. Die Unterschiede bestimmen aber die Farbe des emittierten Lichts. Je nach Art liegt das Emissionsmaximum λmax des freigesetzten Lichts zwischen 530 nm (grün) und 635 nm (rot).
Die Reaktion läuft in vitro am besten bei einem pH-Wert von 7,8 und bei Temperatur von 23–25 °C ab. In vivo ist die Farbe des emittierten Lichts gelbgrün bis gelb (552–582 nm). Im Labor zeigt die Reaktion einen größeren Farbbereich. Im sauren Milieu erscheint das Licht rötlich (615 nm), im neutralen Milieu grün-gelb.
Reaktionsmechanismus mini|hochkant=2|links|Reaktionsmechanismus der Luciferinreaktion (Erklärungen im Text)
Der genaue Mechanismus der Reaktion ist bekannt. Durch ATP wird das D-Luciferin zunächst an der Carboxygruppe adenyliert, wobei Pyrophosphat als Abgangsgruppe freigesetzt wird (1, vgl. Abbildung). Durch diese Aktivierung kann das Proton am C4-Atom abstrahiert werden, es bildet sich ein Carbanion (2). Anschließend kann das Luciferin am C4-Atom oxygeniert werden, es bildet sich ein lineares Hydroperoxid (3). Dieses bildet unter Abspaltung von AMP einen Dioxetanonring (4). Nach Decarboxylierung bildet sich daraus Oxyluciferin, was entweder als Monoanion (Ketoform, 5) oder Dianion (Enolform) vorliegen kann. In beiden Fällen ist das Oxyluciferin in einem energetisch angeregten Zustand. Es fällt unter Abgabe eines Photons (rotes Licht oder gelb-grünes Licht) in seinen Grundzustand zurück. Das Oxyluciferin selbst wurde noch nicht in Reinform isoliert, da es extrem instabil ist.