Unter der Toxizitätsbestimmung versteht man die Feststellung der Giftigkeit oder Schädlichkeit – der Toxizität – eines Stoffes. Dabei kann es sich um potentielle neue Medikamente oder andere Chemikalien handeln. Die Toxizitätsbestimmung beruht auf Methoden, die von den zuständigen internationalen Stellen (insbesondere der OECD, siehe OECD-Richtlinien zur Prüfung von Chemikalien) anerkannt und empfohlen worden sind. Toxizitätsbestimmungen werden in den meisten Fällen mittels Tierversuchen durchgeführt. In vielen Fällen dienen Toxizitätsprüfungen jedoch in erster Linie dem Schutz des Menschen, etwa zur Ermittlung möglicher Nebenwirkungen potentieller neuer Humanmedikamente oder zur Risikobewertung im Kontext des Arbeitsschutzes. Daher fördern politische Initiativen sowohl in der EU, als auch in den USA einen Übergang zu humanbasierten Testsystemen für Toxizitätsprüfungen. Auch Vertreter der pharmazeutischen und der chemischen Industrie unterstützen diesen Paradigmenwechsel. Im Allgemeinen müssen Toxizitätsbestimmungen nach den Regeln der Good Laboratory Practice durchgeführt werden.
Toxikologische Endpunkte Toxizitätsstudien beinhalten die chemischen Konzentrationen oder Verabreichungsmengen der untersuchten Substanzen, Angaben über beobachtete Wirkungen und Dauer der Aussetzung und beziehen sich in der Regel auf einen speziellen toxikologischen Endpunkt.
Einige Beispiele für solche Endpunkte sind: EC50 – Effective Concentration 50 %: Dosis, die bei 50 % einer Versuchspopulation eine andere definierte Wirkung als den Tod auslöst. LC50 – Median Lethal Concentration: Letalkonzentration in Wasser, Boden oder Luft, bei der 50 % der Versuchsorganismen innerhalb eines bestimmten Beobachtungszeitraumes sterben. LD50 – Median Lethal Dose: Letale Dosis, bei der 50 % aller Versuchstiere, denen eine bestimmte Giftmenge verabreicht wurde, sterben. TD50- Median Toxic Dose: Toxische Dosis, bei der 50 % der Versuchsorganismen innerhalb eines bestimmten Beobachtungszeitraumes Anzeichen einer Toxizität zeigen. LOAEL – Lowest Observed Adverse Effect Level: Niedrigste Dosis eines verabreichten chemischen Stoffes, bei der im Tierexperiment noch Schädigungen beobachtet wurden. LOEL – Lowest Observed Effect Level: Niedrigste Dosis eines verabreichten chemischen Stoffes, bei der im Tierexperiment noch Wirkungen beobachtet wurden. NOAEL – No Observed Adverse Effect Level: Höchste Dosis eines Stoffes, die auch bei andauernder Aufnahme keine erkennbaren und messbaren Schädigungen hinterlässt. NOEL – No Observed Effect Level: Höchste Dosis eines Stoffes, die auch bei andauernder Aufnahme keine erkennbaren und messbaren Wirkungen hinterlässt. Der Unterschied zwischen Wirkung und Schädigung ist beispielsweise bei Arzneimitteln von Bedeutung; ein Arzneimittel sollte eine pharmakologische Wirkung bei einer Dosis zeigen, bei der keine toxische Schädigung zu befürchten ist.
Akute Toxizität Akute Toxizität umfasst die schädigenden Wirkungen, die innerhalb eines bestimmten Zeitraums (gewöhnlich 14 Tage) nach Verabreichung einer Einzeldosis einer Substanz auftreten.
Die akuten toxischen Wirkungen sowie die Organ- oder Systemtoxizität einer Substanz kann anhand einer Reihe von Toxizitätsprüfungen bewertet werden, die nach einer Einzeldosis erste Rückschlüsse auf die Toxizität zulassen.
Je nach Toxizität der Substanz kann ein Limit-Test oder ein kompletter Test in Erwägung gezogen werden.
Akute Orale Toxizität: Fest-Dosis-Methode An Gruppen von Versuchstieren eines Geschlechts wird in einem mehrschrittigen Verfahren nach OECD-Guideline 420 jeweils die feste Dosis 5, 50, 300 und 2.000 mg/kg verabreicht. Als Startdosis wird auf der Grundlage einer Vorstudie die Dosis gewählt, die voraussichtlich gewisse Toxizitätsanzeichen verursachen wird, ohne schwere toxische Wirkungen oder Mortalität hervorzurufen. Weiteren Versuchstiergruppen können höhere oder niedrigere feste Dosen in Abhängigkeit davon verabreicht werden, ob Anzeichen von Toxizität oder Mortalität zu erkennen sind. Diese Vorgehensweise wird fortgesetzt, bis die Dosis ermittelt ist, die offensichtlich toxisch wirkt oder den Tod maximal eines Versuchstieres verursacht hat, bzw. bis bei der höchsten Dosis keine Wirkungen zu erkennen sind oder bis bereits bei der niedrigsten Dosis der Tod von Versuchstieren eintritt.
Akute Orale Toxizität: Akute-Toxische Klassenmethode Das Versuchsprinzip der Acute Toxic Class nach OECD-Guideline 423 besteht darin, in einem mehrschrittigen Verfahren bei Verwendung einer minimalen Anzahl von Tieren pro Einzelschritt genügend Informationen über die akute Toxizität der Testsubstanz zu gewinnen, um ihre Klassifizierung zu ermöglichen. Die Substanz wird einer Gruppe von Versuchstieren oral mit einer der festgelegten Dosen verabreicht. Die Substanz wird in einem mehrschrittigen Verfahren getestet, wobei für jeden Schritt jeweils drei Tiere des gleichen Geschlechts (normalerweise weibliche Tiere) verwendet werden. Das Eintreten oder Nichteintreten von prüfsubstanzbedingten Todesfällen bei dem in einem Schritt behandelten Tieren bestimmt über den nächsten Schritt, d. h.:
ob keine weiteren Tests erforderlich sind, ob drei weitere Tiere mit der gleichen Dosis zu behandeln sind, ob der nächste Schritt an drei weiteren Tieren mit der nächsthöheren oder nächstniedrigeren Dosis durchzuführen ist. Die Methode ermöglicht die Beurteilung, eine Testsubstanz innerhalb einer Reihe von Toxizitätsklassen einzuordnen, die durch feste LD50-Abgrenzungswerte definiert sind.
Akute Toxizität (Inhalation) Nach OECD-Guideline 403 werden mehrere Versuchstiergruppen mit der Prüfsubstanz in abgestuften Konzentrationen für eine bestimmte Zeit exponiert, und zwar eine Konzentration je Gruppe. Anschließend werden die beobachteten Auswirkungen und Todesfälle registriert. Tiere, die während des Versuchs sterben, sowie die bei Versuchsende überlebenden Tiere werden seziert.
Akute Toxizität (dermal) Nach OECD-Guideline 402 wird die Prüfsubstanz in abgestuften Dosierungen mehreren Versuchstiergruppen auf die Haut aufgetragen, und zwar eine Dosierung je Gruppe. Anschließend werden die beobachteten Vergiftungserscheinungen und Todesfälle registriert. Tiere, die während des Versuchs sterben, sowie die bei Versuchsende überlebenden Tiere werden seziert.
Akute Toxizität: Hautreizung/-Verätzung Nach OECD-Guideline 404 wird die Prüfsubstanz in einer einmaligen Dosierung auf die Haut eines Versuchstiers aufgetragen; nicht behandelte Hautareale dienen als Kontrolle. Der Grad der Reizung/Verätzung wird in zuvor festgelegten Zeitabständen bestimmt und bewertet und anschließend beschrieben, um eine umfassende Beurteilung der Wirkung vornehmen zu können. Die Beobachtungsdauer soll ausreichend sein, um die Reversibilität bzw. Irreversibilität der Wirkungen vollständig zu erfassen.
Akute Toxizität: Augenreizung/-Verätzung Nach OECD-Guideline 405 (siehe auch Draize-Test) wird die Prüfsubstanz in einer einmaligen Dosierung in ein Auge jedes Versuchstiers eingebracht; das unbehandelte Auge dient als Kontrolle. Der Grad der Reizung/Verätzung wird bestimmt, indem in zuvor festgelegten Zeitabständen Schädigungen der Bindehaut, der Hornhaut und der Iris anhand einer Punkteskala bewertet werden. Darüber hinaus werden auch andere Reaktionen des Auges und systemische Schäden beschrieben, um die Wirkungen vollständig beurteilen zu können. Die Beobachtungsdauer soll ausreichend sein, um die Reversibilität bzw. Irreversibilität der Wirkungen vollständig zu erfassen.
Toxizität bei wiederholter Gabe/subakute, subchronische und chronische Toxizität Toxizität bei wiederholter Gabe/subchronische Toxizität umfasst die schädigenden Wirkungen, die bei Versuchstieren als Ergebnis wiederholter täglicher Verabreichung oder Exposition gegenüber einer chemischen Substanz auftreten. Die Behandlungsdauer erstreckt sich über eine kurze Zeit im Verhältnis zur speziesspezifischen Lebenszeit.
Die Prüfung auf Toxizität bei wiederholter Gabe bewertet die toxischen Wirkungen bei wiederholter Exposition. Hierbei ist die Notwendigkeit einer sorgfältigen klinischen Beobachtung der Tiere zu unterstreichen, um möglichst viele Daten zu gewinnen. Diese Prüfungen sollten dazu beitragen, die Zielorgane der toxischen Wirkungen sowie die toxischen und nichttoxischen Dosen zu ermitteln. Weitere eingehende Untersuchungen dieser Aspekte können in den Langzeitstudien erforderlich sein.
Prüfung auf sub-chronische orale Toxizität: 90-Tage-Toxizitätsstudie bei wiederholter oraler Verabreichung an Nagetieren Bei der Beurteilung und Bewertung der toxischen Merkmale eines chemischen Stoffs kann die Bestimmung der subchronischen Toxizität bei wiederholter oraler Verabreichung von Wirkstoffgaben durchgeführt werden, nachdem erste Toxizitätsdaten anhand von Prüfungen auf akute Toxizität oder 28-Tage-Tests nach OECD-Guideline 407 auf Toxizität bei wiederholter Verabreichung erzielt wurden. Die 90-Tage-Studie nach OECD-Guideline 408 (Nagetiere) oder 409 (Nichtnagetiere) liefert Informationen über mögliche gesundheitliche Schädigungen, die durch wiederholte Exposition über einen längeren Zeitraum, einschließlich der Entwicklung nach dem Abstillen bis zum Erwachsensein, entstehen können. Die Studie liefert ferner Informationen über die wichtigsten toxischen Wirkungen, zeigt die Zielorgane und eine mögliche Bioakkumulation auf und kann zur Ableitung einer NOAEL beitragen, die zur Wahl der Dosierungen für Untersuchungen der chronischen Toxizität und zur Festlegung von Sicherheitskriterien für die Humanexposition herangezogen werden kann.
Die Methode legt außerdem den Schwerpunkt auf neurologische Endpunkte und liefert Hinweise auf immunologische und fortpflanzungsspezifische Wirkungen. Ferner wird die Notwendigkeit sorgfältiger klinischer Beobachtung der Tiere hervorgehoben, um möglichst umfangreiche Informationen zu erhalten. Durch diese Studie sollten chemische Stoffe mit potenzieller neurotoxischer und immunologischer Wirkung sowie Wirkung auf die Fortpflanzungsorgane ermittelt werden, die gegebenenfalls weitergehende Untersuchungen erforderlich machen.
Die Prüfsubstanz wird täglich über einen Zeitraum von 90 Tagen in abgestuften Dosen an mehrere Gruppen von Versuchstieren verabreicht, und zwar eine Dosisstufe je Gruppe. Während des Verabreichungszeitraums werden die Tiere sorgfältig auf Toxizitätsanzeichen beobachtet. Während der Prüfung verendete oder getötete Tiere werden seziert. Am Ende der Prüfung werden alle noch lebenden Tiere getötet und ebenfalls seziert.
Mutagenität (Genotoxizität) Mutagenität oder Genotoxizität bezeichnet die Induktion permanenter vererbbarer Veränderungen in Menge oder Struktur des genetischen Materials von Zellen oder Organismen. Diese Veränderungen, sogenannte Mutationen, können ein einzelnes Gen oder Gensegmente, einen Genblock oder ganze Chromosomen betreffen. Die Wirkungen auf ganze Chromosomen können struktureller und/oder numerischer Art sein.
Rückmutationstest unter Verwendung von Bakterien Beim auch Ames-Test genannten Rückmutationstest an Bakterien nach der OECD-Richtlinie 471 werden Stämme von Salmonella typhimurium und Escherichia coli, die eine bestimmte Aminosäure benötigen, zum Nachweis von Punktmutationen verwendet, die Substitution, Addition oder Deletion eines oder mehrerer DNA-Basenpaare umfassen. Der unter Verwendung von Bakterien durchgeführte Rückmutationstest beruht auf dem Nachweis von Mutationen, durch die Mutationen in den entsprechenden Stämmen rückgängig gemacht und die funktionale Kapazität der Bakterien zur Synthetisierung einer essentiellen Aminosäure wiederhergestellt wird. Die Revertanten-Bakterien lassen sich an ihrer Fähigkeit zum Wachstum ohne die vom Elternstamm benötigte Aminosäure erkennen.