mini|Fusionsprotein (oben) und Spaltung eines Fusionsproteins mit 2A-Peptid (unten) 2A-Peptide sind eine Klasse von viralen Strukturmotiven, welche in Proteinen vorkommen und diese während der Translation teilen.
Eigenschaften Die erste 2A-Peptid-Sequenz wurde im Maul-und-Klauenseuche-Virus (als Übersetzung von engl. Foot-and-mouth disease virus, abgekürzt FMDV) entdeckt. 2A-Peptide wurden in verschiedenen Säugetierviren (der Familie der Picornaviren) und vielen Insektenviren beschrieben.G. A. Luke, P. de Felipe, A. Lukashev, S. E. Kallioinen, E. A. Bruno, M. D. Ryan: Occurrence, function and evolutionary origins of '2A-like' sequences in virus genomes. In: The Journal of general virology. Band 89, Pt 4April 2008, S. 1036–1042, , PMID 18343847, . Die Benennung erfolgte nach dem Namen des Gens einer Peptidase namens 2Apro des Virus, in dem es erstmals gefunden wurde.M. D. Ryan, A. M. King, G. P. Thomas: Cleavage of foot-and-mouth disease virus polyprotein is mediated by residues located within a 19 amino acid sequence. In: The Journal of general virology. Band 72 ( Pt 11), November 1991, S. 2727–2732, , PMID 1658199. So stammt das P2A-Peptid vom Porzinen Teschovirus 1 (als Übersetzung von engl. porcine teschovirus-1, abgekürzt PTV1). Hier führt die 2A-Sequenz zur cotranslationalen Teilung von zwei Proteinen innerhalb eines einzelnen offenen Leserahmens (als Übersetzung von engl. open reading frame, abgekürzt ORF). Es wird angenommen, dass die 2A-Sequenz die Ausbildung einer regulären Peptidbindung am Ribosom inhibiert und es folglich zur Trennung der Peptide während der Translation kommt. Vermutlich wird während der Translation am Ribosom die Bildung einer Gly-Pro-Bindung C-terminal am 2A-Peptid übersprungen.M. L. Donnelly, G. Luke, A. Mehrotra, X. Li, L. E. Hughes, D. Gani, M. D. Ryan: Analysis of the aphthovirus 2A/2B polyprotein 'cleavage' mechanism indicates not a proteolytic reaction, but a novel translational effect: a putative ribosomal 'skip'. In: The Journal of general virology. Band 82, Pt 5Mai 2001, S. 1013–1025, , PMID 11297676.P. Sharma, F. Yan, V. A. Doronina, H. Escuin-Ordinas, M. D. Ryan, J. D. Brown: 2A peptides provide distinct solutions to driving stop-carry on translational recoding. In: Nucleic acids research. Band 40, Nummer 7, April 2012, S. 3143–3151, , PMID 22140113, . Der genaue Mechanismus ist noch unbekannt.Y. Wang, F. Wang, R. Wang, P. Zhao, Q. Xia: 2A self-cleaving peptide-based multi-gene expression system in the silkworm Bombyx mori. In: Scientific Reports. Band 5, November 2015, S. 16273, , PMID 26537835, . Die Spaltung erfolgt stets vor dem C-terminalen Prolin des 2A-Peptids. Daher erhält das zweite (C-terminale) Peptid ein Prolin als N-Terminus und das erste (N-terminale) Peptid die restliche 2A-Sequenz als C-Terminus.
Anwendung Gentechnisch werden 2A-Peptide beim Vektordesign eingesetzt, um ein Protein nach der Expression an gezielter Stelle in zwei Proteine zu teilen.A. L. Szymczak, D. A. Vignali: Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors. In: Expert Opinion on Biological Therapy. Band 5, Nummer 5, Mai 2005, S. 627–638, , PMID 15934839. Dies wird als polycistronische Expression bezeichnet. Ihr Vorteil gegenüber den analog verwendeten IRES Sequenzen ist die äquimolare Expression beider Proteine von einem gemeinsamen Promotor, während bei IRES das zweite Protein in geringerer Menge gebildet wird.G. A. Luke, M. D. Ryan: "Therapeutic applications of the 'NPGP' family of viral 2As". In: Reviews in Medical Virology. Band 28, Nummer 6, 11 2018, S. e2001, , PMID 30094875. Es wurde eine Genexpression von bis zu fünf Proteinen mit vier dazwischenliegenden 2A-Peptiden aus einem Gen beschrieben. Von verschiedenen untersuchten 2A-Peptiden war P2A das 2A-Peptid mit der effizientesten Spaltung, während F2A das mit der geringsten Effizienz war.J. H. Kim, S. R. Lee, L. H. Li, H. J. Park, J. H. Park, K. Y. Lee, M. K. Kim, B. A. Shin, S. Y. Choi: High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. In: PLOS ONE. Band 6, Nummer 4, 2011, S. e18556, , PMID 21602908, . Bei F2A können bis zu 50 % der Fusionsproteine ungespalten bleiben, wodurch unbeabsichtigte neue Funktionen entstehen können.S. Velychko, K. Kang, S. M. Kim, T. H. Kwak, K. P. Kim, C. Park, K. Hong, C. Chung, J. K. Hyun, C. M. MacCarthy, G. Wu, H. R. Schöler, D. W. Han: Fusion of Reprogramming Factors Alters the Trajectory of Somatic Lineage Conversion. In: Cell Reports. Band 27, Nummer 1, 04 2019, S. 30–39.e4, , PMID 30943410. 2A-Peptide können neben Säugetier- und Insektenzellen auch in Saccharomyces cerevisiae,T. M. Souza-Moreira, C. Navarrete, X. Chen, C. F. Zanelli, S. R. Valentini, M. Furlan, J. Nielsen, A. Krivoruchko: Screening of 2A peptides for polycistronic gene expression in yeast. In: FEMS yeast research. Band 18, Nummer 5, 08 2018, , PMID 29617770. KokzidienX. Tang, X. Liu, G. Tao, M. Qin, G. Yin, J. Suo, X. Suo: "Self-cleaving" 2A peptide from porcine teschovirus-1 mediates cleavage of dual fluorescent proteins in transgenic Eimeria tenella. In: Veterinary research. Band 47, Nummer 1, 06 2016, S. 68, , PMID 27352927, . und (mit Modifikationen) in Pflanzen verwendet werden.S. Burén, C. Ortega-Villasante, K. Otvös, G. Samuelsson, L. Bakó, A. Villarejo: Use of the foot-and-mouth disease virus 2A peptide co-expression system to study intracellular protein trafficking in Arabidopsis. In: PLOS ONE. Band 7, Nummer 12, 2012, S. e51973, , PMID 23251667, .B. Zhang, M. Rapolu, S. Kumar, M. Gupta, Z. Liang, Z. Han, P. Williams, W. W. Su: Coordinated protein co-expression in plants by harnessing the synergy between an intein and a viral 2A peptide. In: Plant biotechnology journal. Band 15, Nummer 6, Juni 2017, S. 718–728, , PMID 27879048, . Das C-terminale Protein sollte keine Myristoylierung aufweisen, da durch 2A-Peptide dann die zelluläre Lokalisation verändert werden kann.S. Hadpech, W. Jinathep, S. Saoin, W. Thongkum, K. Chupradit, U. Yasamut, S. Moonmuang, C. Tayapiwatana: Impairment of a membrane-targeting protein translated from a downstream gene of a "self-cleaving" T2A peptide conjunction. In: Protein expression and purification. Band 150, 10 2018, S. 17–25, , PMID 29733907. Die Trennung der Proteine kann durch Transfektion eines Vektors, das für ein Protein-2A-Peptid-Protein codiert, in Zellkulturen mit nachfolgendem Western Blot überprüft werden.A. L. Szymczak-Workman, K. M. Vignali, D. A. Vignali: Verification of 2A peptide cleavage. In: Cold Spring Harbor protocols. Band 2012, Nummer 2, Februar 2012, S. 255–257, , PMID 22301658. Da nach der Spaltung der 2A-Peptide kurze Peptidsequenzen an den Termini der getrennten Proteine zurückbleiben, kann es zu funktionellen Störungen dieser Proteine kommen.
Vertreter Die nachfolgende Tabelle listet die gentechnologisch relevantesten Vertreter der 2A-Peptide auf. Ein „GSG“-Linker (Gly-Ser-Gly) N-terminal vor dem 2A-Peptid kann die Effektivität zudem verstärken. 2A-Peptide besitzen die Konsensussequenz DxExNPGP.X. Yang, A. Cheng, M. Wang, R. Jia, K. Sun, K. Pan, Q. Yang, Y. Wu, D. Zhu, S. Chen, M. Liu, X. X. Zhao, X. Chen: Structures and Corresponding Functions of Five Types of Picornaviral 2A Proteins. In: Frontiers in Microbiology. Band 8, 2017, S. 1373, , PMID 28785248, .
Bezeichnung Sequenz T2A EGRGSLLTCGDVEENPG'P P2A ATNFSLLKQAGDVEENPG'P E2A QCTNYALLKLAGDVESNPG'P F2A VKQTLNFDLLKLAGDVESNPG'P
Einzelnachweise
Kategorie:Gentechnik Kategorie:Protein-Biochemie 2A-Peptide