Der Transcription-Translation Feedback Loop (TTFL), zu deutsch Transkriptions-Translations-Rückkopplungsschleife, ist ein zelluläres Modell zur Erklärung circadianer Rhythmen in Verhalten und Physiologie. Der TTFL ist in vielen Arten konserviert und reguliert sich automatisch. Dabei wird die Transkription von bestimmten Genen, den sogenannten Clock-Genen („Uhr“-Genen), durch ihre eigenen Proteinprodukte reguliert.
Entdeckung Circadiane Rhythmen sind bereits seit Jahrhunderten bekannt. So bemerkte der französische Astronom Jean Jacques d’Ortous de Mairan bereits 1729 die periodische Bewegung von Pflanzenblättern der Mimosen innerhalb von 24 Stunden. Die Wissenschaft hat jedoch erst vor kurzem begonnen, die zellulären Mechanismen aufzudecken, die für den Antrieb der beobachteten circadianen Rhythmen verantwortlich sind. Die zelluläre Basis von circadianen Rhythmen wird durch die Tatsache gestützt, dass Rhythmen in einzelligen Organismen beobachtet wurden.D. Mergenhagen: Circadian rhythms in unicellular organisms. In: Current topics in microbiology and immunology. Band 90, 1980, S. 123–147, , PMID 6775877 (Review).
Ab den 1970er Jahren zeigten Experimente von Ron Konopka et al., bei denen Methoden der Vorwärts-Genetik (englisch: forward genetics) zur Induzierung von Mutationen eingesetzt wurden, dass Arten von Drosophila melanogaster mit veränderten Genen, den sogenannten period-Genen (per), ebenfalls eine veränderte Periodizität aufwiesen. Mit der Verbesserung der genetischen und molekularbiologischen experimentellen Instrumente identifizierten die Forscher weitere Gene, die für die Aufrechterhaltung eines normalen rhythmischen Verhaltens verantwortlich sind. So entstand das Konzept, dass interne Rhythmen durch eine kleine Untergruppe von core clock-Genen modifiziert werden. Paul Hardin et al. schlugen im Jahr 1990 als erste Gruppe vor, dass der Mechanismus, der diese Rhythmen antreibt, eine negative Rückkopplungsschleife ist.
Nachfolgende wichtige Entdeckungen bestätigten dieses Modell. Insbesondere die Experimente unter der Leitung von Thomas K. Darlington und Nicholas Gekakis Ende der 1990er-Jahre identifizierten CLOCK-Proteine und charakterisierten ihre Methoden in Drosophila bzw. Mäusen. Aus diesen Experimenten entstand das TTFL-Modell, das mittlerweile zum vorherrschenden Paradigma für die Erklärung des circadianen Verhaltens für eine Vielzahl von Arten geworden ist.Lisa Wulund, Akhilesh B. Reddy: A brief history of circadian time: The emergence of redox oscillations as a novel component of biological rhythms. In: Perspectives in Science. 6, 2015, S. 27, .
Allgemeine Mechanismen der TTFL Die TTFL ist eine negative Rückkopplungsschleife, in der Clock-Gene durch ihre Proteinprodukte reguliert werden. Im Allgemeinen umfasst die TTFL zwei Rückkopplungsschleifen: positive regulatorische Elemente, die die Transkription fördern und Proteinprodukte, die die Transkription unterdrücken. Wenn ein positives regulatorisches Element an einen Clock-Promotor bindet, schreitet die Transkription voran, was zur Bildung eines mRNA-Transkripts führt. Anschließend erfolgt die Translation, was zu einem Proteinprodukt führt. Es gibt charakteristische Verzögerungen zwischen mRNA-Transkriptakkumulation, Proteinakkumulation und Gen-Silencing aufgrund der Translationsdynamik, posttranslationalen Modifikation, Proteindimerisierung und intrazellulärem Transport zum Zellkern.M. H. Hastings, E. S. Maywood, J. S. O’Neill: Cellular circadian pacemaking and the role of cytosolic rhythms. In: Current Biology. Band 18, Nummer 17, September 2008, S. R805–R815, , PMID 18786386 (Review).
Artübergreifende Proteine, die sich am TTFL beteiligen, enthalten gemeinsame Strukturmotive wie PAS-Domänen, die an Protein-Protein-Wechselwirkungen beteiligt sind und bHLH-Domänen, die an der DNA-Bindung beteiligt sind.J. C. Dunlap, J. J. Loros, Y. Liu, S. K. Crosthwaite: Eukaryotic circadian systems: cycles in common. In: Genes to cells : devoted to molecular & cellular mechanisms. Band 4, Nummer 1, Januar 1999, S. 1–10, PMID 10231388 (Review).
Modelle Das Vorhandensein der TTFL ist bei allen Tierarten stark konserviert. Viele der am Prozess beteiligten Akteure haben sich jedoch im Laufe der Entwicklungszeit innerhalb verschiedener Arten verändert. Beim Vergleich von Pflanzen, Tieren, Pilzen und anderen Eukaryoten gibt es Unterschiede in den Genen und Proteinen, die an der TTFL beteiligt sind. Dies deutet darauf hin, dass sich eine „Uhr“, die dem TTFL-Modell folgt, während der Existenz des Lebens mehrmals entwickelt hat.A. S. Loudon: Circadian biology: a 2.5 billion year old clock. In: Current Biology. Band 22, Nummer 14, Juli 2012, S. R570–R571, , PMID 22835791. +Regulierung der Clock-GeneDrosophila melanogasterPositive RegulatorenCYC, ClockNegative RegulatorenTIM, PERSäugetierePositive RegulatorenBMAL1, CLOCKNegative RegulatorenPER1, PER2, CRY1, CRY2NeurosporaPositive RegulatorenWC-1, WC-2Negative RegulatorenFRQ
Drosophila melanogaster Der TTFL wurde erstmals in Drosophila entdeckt und das System weist mehrere Gemeinsamkeiten mit der TTFL von Säugetieren auf. Die Transkription der Clock-Gene period (per) und timeless (tim) wird initiiert, wenn die positiven Proteinelemente CYCLE (dCYC) und CLOCK (dCLK) ein Heterodimer bilden und E-Box-Promotoren binden, wodurch die Transkription initiiert wird. Während des Tages wird das Proteinprodukt TIM abgebaut; Belichtung erleichtert das Binden des Proteins CRY an TIM, wodurch TIM ubiquitiniert und schließlich abgebaut wird.T. Yoshii, C. Hermann-Luibl, C. Helfrich-Förster: Circadian light-input pathways in Drosophila. In: Communicative & integrative biology. Band 9, Nummer 1, 2016 Jan-Feb, S. e1102805, , PMID 27066180, (Review). In der Nacht können TIM und PER Heterodimere bilden und sich langsam im Cytoplasma ansammeln, wo PER durch die Kinase DBT (double-time protein) phosphoryliert wird. Die posttranskriptionelle Modifikation mehrerer Phosphatgruppen dient zum Abbau des Komplexes und zur Erleichterung der Lokalisation des Komplexes im Zellkern. Im Zellkern bindet das PER-TIM-Dimer an das CYC-CLK-Dimer, wodurch das CYC-CLK-Dimer aus den E-Boxen freigesetzt und die Transkription inhibiert wird. Sobald sich PER und TIM zersetzen, können CYC-CLK-Dimere die E-Boxen erneut binden, um die Transkription zu initiieren und die negative Rückkopplungsschleife zu schließen.T. S. Andreani, T. Q. Itoh, E. Yildirim, D. S. Hwangbo, R. Allada: Genetics of Circadian Rhythms. In: Sleep medicine clinics. Band 10, Nummer 4, Dezember 2015, S. 413–421, , PMID 26568119, (Review). mini|260x260px|Die Abbildung zeigt den TTFL von Drosophila melanogaster und seine allgemeinen Wechselwirkungen zwischen den Hauptakteuren. Es ist erkennbar, wie CLK und CYC (gelb und grün) die positiven sowie PER und TIM (rot und blau) die negativen Regulatoren sind, die jeweils eine Rolle in der circadianen Uhr spielen.
Sekundäre Rückkopplungsschleifen interagieren mit der primären Rückkopplungsschleife. CWO (Clockwork Orange Drosophila protein) bindet die E-Boxen als direkten Konkurrenten von CYC-CLK und hemmt so die Transkription. PDP1ε (par domain protein 1ε) ist ein Rückkopplungsaktivator und VRI (vrille) ist ein Rückkopplungsinhibitor des Clock-Promotors; ihre Expression wird durch dCLK-dCYC aktiviert. Das Ecdyson-induced Protein 75 (E75) hemmt die Clock-Expression und aktiviert sich zeitabhängig pro Transkription. Sämtliche sekundäre Schleifen verstärken den primären TTFL.
Cryptochrom in Drosophila ist ein Blaulicht-Photorezeptor, der den Abbau von TIM auslöst und indirekt dazu führt, dass die Taktphase zurückgesetzt und die Expression des per-Gens erneut gefördert wird.
Säugetiere mini|Die Abbildung zeigt den TTFL bei Säugetieren und die allgemeinen Wechselwirkungen zwischen den Hauptakteuren. Sie zeigt, wie sowohl PER als auch CRY negative Regulatoren (rote Pfeile) für BMAL1 und CLOCK sind, da sie eine Hemmung von BMAL1 und CLOCK bewirken, indem sie die Transkription verhindern. BMAL1 und CLOCK (grüne Pfeile) sind positive Regulatoren, da sie die Transkription und später die Translation von PER und CRY fördern.|alt=|260x260px
Das TTFL-Modell der Säugetiere enthält viele Komponenten, die Homologen derjenigen sind, die in Drosophila gefunden wurden. Der TTFL der Säugetiere arbeitet so, dass BMAL1 mit CLOCK ein Heterodimer bildet, um die Transkription von mPer und cryptochrom (cry) zu initiieren. Es gibt drei Paraloge oder historisch ähnliche Gene, die heutzutage als Duplikation des period-Gens in Säugetieren auftreten, die als mPer1, mPer2 und mPer3 aufgeführt sind. Es gibt auch zwei Paraloge von Cryptochrom bei Säugetieren. PER- und CRY-Proteine bilden ein Heterodimer und die Phosphorylierung von PER durch CK1δ (Casein kinase I isoform delta) und CK1ε (Casein kinase 1 isoform epsilon) reguliert die Lokalisierung des Dimers zum Zellkern. Im Zellkern reguliert PER-CRY die Transkription ihrer verwandten Gene negativ, indem es BMAL1-CLOCK bindet und sie vom E-Box-Promotor freisetzt.
Obwohl die mPer-Paraloge als funktionale Orthologen von dPer zusammenarbeiten, haben sie jeweils eine besondere Funktion. mPer1 und mPer2 sind für die „Uhrfunktion“ im Gehirn notwendig, während mPer3 nur im circadianen Rhythmus peripherer Gewebe eine erkennbare Rolle spielt. Beim Gen-Knockout von mPer1 oder mPer2 bewirkt eine Änderung der Freilauf-Periode (τ), wobei mPer1 mit einer kürzeren Periode und mPer2 mit einer längeren Periode im Vergleich zur ursprünglichen Periode ausfällt, bevor es schließlich zu einer Arrhythmie kommt. In ähnlicher Weise führen mCry1-Knockouts zu einer verkürzten Periode und mCry2-Knockouts zu einer verlängerten Periode, wobei ein doppelter mCry1- oder mCry2-Knockout zu Arrhythmie führt.
Es gibt auch sekundäre Schleifen bei Säugetieren, obwohl diese komplexer sind als bei Drosophila. Wie bei CWO in Drosophila unterdrücken Dec1 (Deleted in esophageal cancer 1) und Dec2 (Deleted in esophageal cancer 2) die mPer-Expression durch Binden von E-Boxen, wodurch der Proteinkomplex CLOCK-BMAL1 daran gehindert wird, sich an die E-Boxen zu binden. Die Rezeptoren Rev-erb und ROR (RAR-related orphan receptor) spielen eine ähnliche Rolle wie PDP1ε und VRI in Drosophila, außer dass sie den CLOCK-Bindungspartner BMAL1 regulieren, anstatt CLOCK direkt zu regulieren. DBP (D site of albumin promoter (albumin D-box) binding protein) und E4BP4 (E4 Promoter-Binding Protein 4) binden an die D-Box-Promotorsequenz, um die mPer-Expression zu regulieren.
Die Art und Weise, wie diese Gene mit Drosophila melanogaster in Beziehung stehen, wird in der Funktion jedes einzelnen Gens gesehen und in der Art und Weise, in der sie sich evolutionär verändert haben. BMAL1 ist ein Ortholog von CYCLE. Dies bedeutet, dass BMAL1 und CYCLE scheinbar eine gemeinsame Vorgeschichte haben, jedoch bei verschiedenen Arten vorkommen. Ein weiteres Beispiel für die Parallelen zwischen Drosophila melanogaster und Säugetieren findet sich auch in cry und mPer, da es sich um funktionelle Orthologe von per und tim handelt.
Neurospora mini|260x260px|Überblick über den TTFL der Neurospora und die allgemeinen Wechselwirkungen zwischen den Regulierungselementen. In diesem Fall werden WC-1 und WC-2 (rot) als die positiven Elemente angesehen, bei denen sie zusammenkommen, um die Transkription von FRQ zu fördern. FRQ (grün) ist der negative Regler, der nach der Translation als negative Rückkopplung zurückkommt.
Das Gen frequency (frq) in Neurospora wurde 1979 von J. F. Feldman und seinen Kollegen als das damals zweite bekannte Clock-Gen identifiziert. FRQ wurde erstmals 1989 von C. R. McClung und seinen Kollegen geklont. Dieses Gen war von besonderem Interesse, da seine Expression im Vergleich zu anderen bekannten mikrobiellen Genen sehr komplex ist.