mini|Überlagerung einer Fluoreszenzmikroskopie (grün) mit einem DIC-Bild einer HeLa-Zelle, die eine gelb fluoreszierendes Paraspeckle Protein 1 (PSPC1) exprimiert: 1. Zytoplasma; 2. Kern; 3. Nucleolus; 4. Paraspeckles.
Paraspeckles sind unregelmäßig geformte, membranlose Körper in Zellkernen. Sie haben einen Durchmesser von ca. 0,2–1 µm. Pro Zellkern kann es etwa 2–20 Paraspeckles geben, abhängig vom Zelltyp. Ihr Name leitet sich von ihrer Verteilung im Kern ab; "para" steht für parallel und "speckle" bezieht sich auf die Nuclear Speckles, die immer in unmittelbarer Nähe aufzufinden sind.
Paraspeckles sind entscheidend für die Kontrolle der Genexpression durch das Aufbewahren von Proteinen und RNA. Durch diesen Mechanismus als "molekularer Schwamm" können Paraspeckles und ihre Komponenten eine Rolle bei der Kontrolle der Genexpression während vieler zellulärer Prozesse wie Differenzierung, Virusinfektion und Stressreaktionen spielen.
Sie bilden sich auf Basis einer langen, nicht kodierenden RNA, die als NEAT1 bezeichnet wird. Durch eine Reihe von Studien wurden ihre molekularen Komponenten, die inneren Strukturen sowie deren zelluläre und physiologische Funktionen charakterisiert. Hinweise deuten darauf hin, dass die Bildung von Paraspeckles durch Phasentrennung von RNA-bindenden Proteinen hervorgerufen wird. Diese enthalten ungeordnete Regionen, durch die eine geordnete Anordnung von Paraspeckle-Komponenten entlang der NEAT1-RNA vermittelt wird.
Paraspeckles existieren nicht in humanen embryonalen Stammzellen, sondern bilden sich erst nach deren Differenzierung. Mäuse, bei keine NEAT1-RNA bilden können, sind unter Laborwachstumsbedingungen lebensfähig, so dass Paraspeckles als nicht essentielle Nukleärkörper betrachtet werden. Sie werden bei bestimmten Umweltauslösern wie Virusinfektion, Proteasomhemmung und Differenzierung gebildet. Paraspeckles sind auf Zellkerne von Säugetieren beschränkt.
Entdeckung Paraspeckles wurden 2002 durch eine Studie von Proteinen in menschlichen Kernkörperchen (Nucleolus) entdeckt. Durch eine proteomische Analyse von gereinigten menschlichen Nucleoli mithilfe der Massenspektrometrie wurde festgestellt, dass etwa 30 % neuartige Proteine waren. Weitere Analysen an einem dieser neu identifizierten Proteine zeigten, dass sie nicht in Nucleoli angereichert waren, wie erwartet, sondern diffus innerhalb des Karyoplasma verteilt waren. Sie wurden in ca. 5–20 Schwerpunkten im Zellkern konzentriert gefunden. Diese Punkte wurden in der Nähe von der Nuclear Speckles beobachtet und wurden daher als "Paras-Speckles" bezeichnet. Paraspeckles können auch als elektronendichte Strukturen in der Elektronenmikroskopie identifiziert werden.
Das neuartige Protein, das in diesen Strukturen lokalisiert war, wurde später "Paraspeckle Protein 1" (PSPC1) genannt. Sie enthielten zudem ein weiteres Protein namens "NONO". Beide Proteine sind Mitglieder der DHBS (Drosophila brain human splicing)-Familie von RNA-bindenden Proteinen. Bei späteren Untersuchungen wurden zwei weiteren Paraspeckle-Proteine, SFPQ und CFIm68, entdeckt.
Als Zellen mit Medikamenten behandelt wurden, die die Transkription der RNA Polymerase II (Pol II) hemmen, sammelte sich PSPC1 in halbmondförmigen Strukturen an („perinukleoläre Kappe“). Dies wurde auch in der Telophase des Zellzyklus, in der keine Transkription der RNA Polymerase II stattfindet, festgestellt. Hier lösen sich die Paraspeckles auf und ihre Komponenten akkumulieren in den Nukleoli. Dort ordnen sich die Paraspeckles-Proteine halbmondförmig an und bilden die perinukleoläre Kappe.
Beteiligte RNA und Proteine Neben NEAT-RNA enthalten Paraspeckles mehrere RNA-bindende Proteine. Drei davon sind Mitglieder der Drosophila Behavior Human Splicing (DBHS)-Familie - NONO (P54NRB), SFPQ (PSF) und PSPC1 (PSP1). Diese DBHS-Proteine scheinen eine Schlüsselrolle für die strukturelle Integrität von Paraspeckles zu spielen: Das Ausschalten der häufig vorhandenen Proteine NONO oder SFPQ in HeLa-Zellen führte zu einem Verlust von Paraspeckles. Die Proteine NONO, PSPC1 und SFPQ teilen sich ca. 50 % ihrer Sequenzabfolge.
Zusätzlich enthalten Paraspeckles auch ca. 40 weitere assoziierte Proteine. Diese Proteine sind an mehreren RNA-Stoffwechselwegen wie die Verarbeitung der RNA und der RNA-Stabilität beteiligt. Sie binden sowohl an doppel- als auch an einzelsträngige DNA und RNA. Sie enthalten zwei RNA-bindende Motive an ihrem aminoterminalen Ende.
Das Protein PSPC1 wird am häufigsten als Marker für Paraspeckles verwendet. Darüber hinaus ist die Möglichkeit der RNA-Bindung auch für die Lokalisierung von PSPC1 zu Paraspeckles erforderlich. Die Fähigkeit von PSPC1 mit NONO zu heterodimerisieren ist notwendig, damit es zu Paraspeckles und den perinukleäre Kappen lokalisiert.
Das Protein NONO wurde bei zahlreichen nukleären Ereignissen nachgewiesen, darunter u. a. die Transkriptionsregulation, Spleißen, DNA-Entwicklung, virale RNA-Verarbeitung und Zellproliferation.
Eine weitere für Paraspeckles relevante Funktion ist die Beteiligung von SFPQ- und NONO-Proteinen an der nukleären Einbehaltung von RNA-Molekülen. Diese verhindert, dass eine durch A-zu-I-Edierung verarbeitete RNA den Kern verlässt. Bei diesem Mechanismus wird bis zu der Hälfte aller Adenosine (A) in der RNA in Inosine (I) umgewandelt. Dies tritt meist bei doppelsträngigen RNA-Molekülen auf, die in ihrer Nukleotidsequenz umgekehrte Wiederholungen () enthalten. Mit dem, was vermutlich als antiviraler Mechanismus entstanden ist, kann die resultierende inosinhaltige RNA im Kern gehalten werden, anstatt in das Cytoplasma exportiert zu werden.
Durch ihre Rolle in Prozessen wie Spleißen und Transkription sind die biologischen Auswirkungen der DBHS-Proteine weitreichend. Ein weiteres Beispiel zeigt eine konservierte Rolle von NONO bei Säugetieren bei der Kontrolle des circadianen Rhythmus. NONO wird für die Aufrechterhaltung des circadianen Rhythmus von Säugetieren durch Assoziation mit dem PERIOD-1-Protein benötigt. DBHS-Proteine erfüllen wahrscheinlich ihre vielfältigen Funktionen, indem sie ihre Bindungspartner variieren, posttranslationale Modifikationen sowie subzelluläre und subnukleäre Lokalisationen durchführen.
Paraspeckle RNA Nach der ersten Entdeckung von Paraspeckles deuteten mehrere Beobachtungen darauf hin, dass Paraspeckles neben Proteinen auch RNA enthalten. Es wurden zwei Arten von RNAs identifiziert, die spezifisch für Paraspeckles sind und jeweils Hinweise deren Bildung und Funktion liefern.
Ctn: Rolle der Paraspeckles bei der nukleären Einbehaltung der RNA mini|Genexpression durch nukleäre Einbehaltung. RNA-Transkripte, die doppelsträngige RNA-Regionen (gebildet durch invertierte Wiederholungselemente) enthalten, unterliegen der A-zu-I-Edierung und bleiben im Kern und in den Paraspeckels erhalten. Im Falle von Ctn vermitteln Stresssignale die Spaltung der 3′-UTR und die Freisetzung der RNA aus dem Kern. Die Entdeckung der ersten Paraspeckle-RNA in der Maus zeigte, wie diese RNAs an der Kontrolle der Genexpression beteiligt sind, indem sie die RNA im Zellkern einbehalten. Die Ctn RNA der Maus ist ein alternatives Transkript, das aus dem mCAT2-Gen generiert wird. Sie ist 8 kb lang und ist Teil einer antiviralen Reaktion. Neben seiner homogenen Verteilung im Karyoplasma lokalisiert es auch zu Paraspeckles.
Ctn unterscheidet sich von der mCAT2 mRNA dadurch, dass sie einen anderen Promotor verwendet und an ihrem 3' Ende eine viel längere unübersetzte Region (UTR) enthält. Beide RNA-Varianten verhalten sich gegensätzlich: mCAT2 wird aus dem Kern exportiert und normal übersetzt. Ctn verbleibt jedoch im Kern und in den Paraspeckles einiger Zelltypen. Der Schlüssel zur Einbehaltung dieser RNA in den Paraspeckles liegt in der langen 3′ UTR-Region von Ctn. Diese enthält doppelsträngige RNA-Haarnadelstrukturen, die durch das A-zu-I-Edierung verändert wurden. Erst durch eine Reaktion auf Stresssignale wird die lange 3′ UTR von Ctn abgespalten. Dann wird die Ctn-RNA ins Cytoplasma exportiert und dort von den Ribosomen übersetzt.
Das Spaltungsereignis ist mit einem gleichzeitigen Anstieg der kürzeren mCAT2 mRNA im Cytoplasma und einer erhöhten Proteinproduktion verbunden. Da das mCAT2-Protein die Aufnahme von Vorläufern im NO-Reaktionsweg vermittelt, ermöglicht dieser Freisetzungsmechanismus der Zelle, schnell eine NO-Reaktion auf eine Stresssituation zu aktivieren.
Obwohl Ctn beim Menschen nicht vorhanden ist, liefert dies Hinweise darauf, dass nukleäre Retention der RNA weit verbreitet ist, da bis zur Hälfte der menschlichen Transkripte erweiterte UTRs haben könnten. Eine bioinformatische Studie hat gezeigt, dass viele hundert menschliche Transkripte mit invertierten Wiederholungen auch in einer kürzeren Form vorliegen, in der die invertierten Wiederholungen entfernt wurden. Dies deutet darauf hin, dass die Entfernung von invertierten Wiederholungen im Allgemeinen als Mechanismus für die Freigabe von Transkripten aus der nukleären Speicherung verwendet werden kann.
NEAT1: eine lange nichtcodierende RNA in Paraspeckles
Eine lange nicht kodierende RNA (long non-coding RNA, lncRNA) namens NEAT1 fungiert als Gerüst für Paraspeckles, indem sie viele RNA-bindende Proteine rekrutiert, die an Entwicklung, Krebs und Neurodegeneration beteiligt sind. NEAT1 ist für die Bildung und Aufrechterhaltung von Paraspeckles unerlässlich: Sie formieren sich in Abwesenheit von NEAT1 nach vorübergehender Transkriptionshemmung nicht erneut, und das Ausschalten des NEAT1-Gens führt zum Verlust von Paraspeckles.
Gene, die für NEAT1 und MALAT1 kodieren, befinden sich typischerweise dicht beieinander in Säugetiergenomen, etwas entfernt vom nächsten Protein kodierenden Gen. Sie sind beide im Zellkern angereicherte ncRNA (nichtcodierende RNA). Ein weiteres Merkmal von NEAT1 und MALAT1 ist, dass die langen RNAs, die von jedem Gen transkribiert werden, beide an ihren 3′-Enden gespalten werden, um ein ungewöhnliches kleines tRNA-ähnliches Molekül zu produzieren. Dies könnte ein Markenzeichen einiger nukleärer ncRNAs sein. Bei beiden dieser ncRNAs wurde nachgewiesen, dass sie zu bestimmten Orten im Zellkern lokalisieren, MALAT1 innerhalb von Nuclear Speckles und NEAT1 an Orten, die an angrenzenden Nuclear Speckles liegen. Bei NEAT1 wurde nachwiesen, dass sie in Paraspeckles lokalisieren und dass die NEAT1-RNA zudem für die Integrität der Paraspeckles unerlässlich ist.
Zwei Isoformen von NEAT1 werden transkribiert, NEAT1_v1 und NEAT1_v2 (auch bekannt als MEN-ϵ und MEN-β). Sie überlappen sich in ca. 3–4 kb ihrer Sequenz auf der 5'-Seite. Beide Transkripte lokalisieren in Paraspeckles in Maus- und menschlichen Zellen. Die Beschränkung von NEAT1 auf Paraspeckles ist größer als bei DBHS-Proteinen wie NONO, das ebenfalls im Karyoplasma reichlich vorhanden ist. NEAT1_v2 wird durch spezielle Triple-Helix-Strukturen stabilisiert. NEAT1_v2 bildet den Paraspeckle-Kern, während NEAT1_v1 als Nebenfaktor verwendet wird. Während sich auch andere Proteinkomponenten von Paraspeckles diffus im gesamten Karyoplasma befinden, kommt die NEAT1-RNA fast ausschließlich in Paraspeckles vor.