Die pharmazeutische Biotechnologie ist eine anwendungsorientierte Wissenschaft, die wissenschaftliche Methoden und Techniken zur Entwicklung, Prüfung, Herstellung und Zulassung von Arzneistoffen umfasst. Es handelt sich somit um ein Teilgebiet der Roten Biotechnologie. Die pharmazeutische Biotechnologie steht in enger Verbindung mit Bioprozesstechnik, Gentechnik, Analytik, pharmazeutischer Technologie und Arzneimittelzulassung. mini|Forschungsfeld Pharmazeutische Biotechnologie
Herstellung biotechnologischer Arzneimittel Die biotechnologische Herstellung rekombinanter Arzneimittel (Biopharmazeutika) hat in der modernen Pharmazie einen breiten Stellenwert eingenommen. Neben der Schaffung gentechnisch veränderter Organismen (GVO) zur Produktion rekombinanter therapeutischer Proteine, ist die historische Fermentation von Bakterien und Pilzen zu nennen, die die industrielle Herstellung von niedermolekularen Arzneistoffen wie beispielsweise Antibiotika, HMG-CoA-Reduktase-Inhibitoren und Immunsuppressiva erlaubte. Wesentlicher Unterschied zu GVO ist, dass die natürliche biochemische Stoffwechselleistung des Produktionsorganismus ausgenutzt wird. Züchterische Verbesserungen der Produktausbeute, wie für Penicillium eindrucksvoll seit dem Zweiten Weltkrieg gezeigt, sind zu unterscheiden von der bewussten Isolierung und Veränderung genomischer DNA des Produzenten, der über neue nicht artspezifische Biosyntheseleistungen verfügt.
30 Jahre nach den ersten erfolgreichen Klonierungsversuchen zur Einführung nicht artspezifischer genetischer Informationen in Escherichia coli ist die genetische Veränderung unterschiedlicher Produktionsorganismen und die Gewinnung beliebiger rekombinanter Proteine einschließlich physiologischer Glykosylierungsvarianten Routine geworden. Heute sind 115 Medikamente mit 84 therapeutischen Proteinen in Arzneimitteln zur Anwendung am Menschen zugelassen (Stand Februar 2006). Optimistische Schätzungen geben an, dass bis 2015 die Hälfte der neuen innovativen Arzneimittel Proteine oder Oligopeptide sein werden, und eine Steigerung der Apothekenumsätze von € 220 Mio. (1996) auf über € 1 Mrd. Ende des Jahrzehntes zu erwarten ist. Parallel ist auch die Vermarktung von Arzneimitteln als Biosimilars (auch gelegentlich als Biogenerika bezeichnet) zu erwarten.
Alle rekombinant hergestellten therapeutischen Produkten müssen der Monographie „DNA-rekombinationstechnisch hergestellte Produkte“ des Europäischen Arzneibuches genügen. Folgende Definition des Europäischen Arzneibuches ist gegeben, die sich mit den Leitlinien der Europäischen Arzneimittelagentur und der Food and Drug Administration (FDA) inhaltlich decken: „DNA-rekombinationstechnisch hergestellte Produkte werden durch genetische Modifikation hergestellt, bei der die für das benötigte Produkt codierende DNA mit Hilfe eines Plasmids oder viralen Vektors in einen geeigneten Mikroorganismus oder eine geeignete Zelllinie eingeführt wird, in denen diese DNA exprimiert und translatiert wird. Das gewünschte Produkt wird dann durch Extraktion und Reinigung gewonnen. Die vor der Aufnahme des Vektors vorliegende Zelle oder der Mikroorganismus wird als Wirtszelle bezeichnet, die im Herstellungsprozess verwendete stabile Verbindung der beiden als Wirt-Vektor-System.“
Aus der Monographie ergibt sich, dass das biotechnologisch erzeugte Produkt durch den gesamten Herstellungsprozess charakterisiert sein muss. Nicht nur die Frage nach der chemischen Identität und Reinheit ist entscheidend, sondern auch die des biologischen Produktionssystems sind relevant für die Identität des therapeutischen Proteins. Im Gegensatz zu nicht rekombinant produzierten klassischen Stoffen ist die Erweiterung der Definition um Fragen des Vektors, der Produzentenlinie und der Extraktion und Reinigung ein zusätzlicher Sicherheitsaspekt, da durch Wechsel der Produktionslinie und Abänderungen der Arbeitsmethodik Endprodukte mit nicht bekannten oder unterschiedlichen Metaboliten entstehen können, die toxikologisch und pharmakokinetisch für den Patienten von Bedeutung sind.
Wie alle Produktionsprozesse in der Pharmazie muss auch die Herstellung biotechnologischer Arzneimittel nach den Regeln der Good Manufacturing Practice (GMP) durchgeführt werden.
Produktion biotechnologischer Produkte Die Herstellung biotechnologischer Therapeutika lässt sich in einen Herstellungs- oder Upstream-Prozess und einem Aufreinigungs- oder Downstream-Prozess unterscheiden. Im Rahmen des Upstream-Prozesses erfolgt die Anzucht des Produktionsstammes aus Zellbanken und die sukzessive Kultivierung und Biomassevermehrung über Erlenmeyerkolben oder Laborfermenter zum industriellen Produktionsfermenter. Ist das gewünschte Protein in ausreichender Menge produziert, erfolgt im Downstream-Prozess die Abreicherung, Inaktivierung, Extraktion und Aufreinigung des gewünschten Produktes sowie die bioanalytischen Prüfungen und galenische Formulierung des Produktes. mini|Typische Upstream und Downstreamschritte in der Herstellung biotechnologischer Arzneimittel
Produktionslinien und Vektorsysteme Mikroorganismen Der überwiegende Teil der rekombinanten Wirkstoffe wird in Mikroorganismen produziert, wobei Escherichia coli als wichtigster Produzent zu nennen ist. Der Einsatz von Mikroorganismen ist wegen der einfachen und anspruchslosen Kultivierung von Vorteil. Weitere Vorteile sind die im Vergleich zu Säugerzellen meist kürzeren Fermentationszeiten und die höhere chemische und physikalische Proteinstabilität bei der Aufarbeitung. Mikroorganismen sind häufig einfacher zugänglich für genetische Manipulationen als tierische oder pflanzliche Zellen.
Industriell eingesetzte Produktionsorganismen müssen den Status GRAS („Generally recognized as safe“ oder im Deutschen „Generell als sicher angesehen“) aufweisen, d. h. sie dürfen nicht pathogen sein und keine toxischen oder antibiotischen Stoffe bilden. Typische Beispiele sind E. coli K12, Bacillus subtillis, Lactobacillen und einige Streptomyces-Arten als Vertreter für Bakterien, und Aspergillus, Penicillium, Pichia, Mucor, Rhizopus und besonders Saccharomyces cerevisae als typische Vertreter für filamentöse Pilze. Zu beachten ist, dass in der Regel niedermolekulare Naturstoffe in das Medium abgegeben werden. Hochmolekulare Stoffe wie hier diskutierte rekombinante Proteine (Bsp. Insulin, Interferone) werden intrazellulär akkumuliert und können als sogenannte Einschlusskörperchen ausfallen.
Säugerzellen Die Produktion von Proteinen durch Säugerzellen findet bevorzugt statt, wenn ein glykosyliertes Produkt gewünscht ist (Bsp. Follitropin, Erythropoietin) oder ein Therapeutikum gefordert ist, das der humanen Konformation entsprechen muss. Tierische Zellen und Mikroorganismen unterscheiden sich in diesen Anforderungen deutlich voneinander. So sind Bakterien nicht zur posttranslationalen Glykosylierung befähigt und sind nur bedingt zur korrekten Proteinfaltung humaner Proteine in der Lage. Bei der therapeutischen Anwendung dieser Produkte werden hohe Anforderungen an die Qualität hinsichtlich Reinheit und ihrer Struktureigenschaften gestellt. Korrekte Faltung und Glykosylierung sind entscheidende Faktoren für die biologische und pharmakologische Aktivität der Zielproteine.
Bei Einsatz von Säugerzellen ist eine technisch höherwertige Ausstattung der Produktionsstätte erforderlich. Von den in der pharmazeutischen Biotechnologie eingesetzten Zelllinien aus der molekularbiologischen Forschung sind folgende Linien als Expressionssysteme von besonderem Interesse: beispielsweise die Chinese Hamster Ovar (CHO)-Zelllinien, Baby Hamster Kidney (BHK)-Zelllinien, Affennieren-Zelllinien vom Vero-Typ in der Impfstoffproduktion und Maus-Myelomzellen (NSO-GS) als Genexpressionssysteme für rekombinante Proteine.
Pflanzen mini|Moosbioreaktor zur Produktion von Biopharmazeutika Als eine Alternative zu den etablierten Produktionssystemen werden zunehmend genetisch veränderte Pflanzen, sogenannte Pharmapflanzen, genutzt. So werden beispielsweise Wasserlinsen wie Lemna minor oder das Moos Physcomitrella patens zur Produktion von Biopharmazeutika eingesetzt.A. Büttner-Mainik, J. Parsons, H. Jérome, A. Hartmann, S. Lamer, A. Schaaf, A. Schlosser, P. F. Zipfel, R. Reski, E. L. Decker: Production of biologically active recombinant human factor H in Physcomitrella. In: Plant Biotechnology Journal. 9, 2011, S. 373–383. doi:10.1111/j.1467-7652.2010.00552.x Diese Pflanzen lassen sich, ebenso wie Pflanzenzellkulturen, in geschlossenen Systemen kultivieren (Photobioreaktoren, z. B. Moosbioreaktor) und ermöglichen somit Herstellbedingungen nach GMP-Richtlinien.Eva L. Decker, Ralf Reski: Moss bioreactors producing improved biopharmaceuticals. In: Current Opinion in Biotechnology. 18, 2007, S. 393–398. doi:10.1016/j.copbio.2007.07.012. Im Optimalfall ist eine direkte Aufreinigung des Proteins aus dem Kulturmedium möglich, was den Downstream-Prozess erleichtert und die Produktionskosten senkt.A. Baur, R. Reski, G. Gorr: Enhanced recovery of a secreted recombinant human growth factor using stabilizing additives and by co-expression of human serum albumin in the moss Physcomitrella patens. In: Plant Biotech. J. 3, 2005, S. 331–340. doi:10.1111/j.1467-7652.2005.00127.x
Zellbänke Die nachhaltige Qualität eines produzierten Wirkstoffs hängt entscheidend von dem eingesetzten Produzenten ab. Die Pflege und Aufrechterhaltung einer Produzentenlinie mit hoher Qualität für die chargenweise Produktion über einen längeren Zeitraum ist für den pharmazeutischen Unternehmer von hohem Interesse, da das zugelassene Produkt nur in der von der Zulassungsbehörde genehmigten Zelllinie hergestellt werden darf. Die Validierung von Zellbänken und Säugerzelllinien muss deshalb durchgeführt werden, um die Zuverlässigkeit eines Produktionsprozesses zu dokumentieren und eine hohe Produktqualität zu reproduzieren. Die genetisch konstruierte Zelllinie zur Produktion wird aus diesem Grunde von der R&D-Zellbank („Research-and-Development-Zellbank“) zur sogenannten Master-Seed bzw. Master-Zellbank kultiviert, um einen Grundstock zur Aliquotierung für Arbeitszelllinien (Working-Seeds) mit mehreren hundert Ampullen zu ermöglichen, die in flüssigem Stickstoff gelagert und bei Bedarf entnommen werden. Außerdem wird für Dokumentation und Qualitätskontrolle zusätzlich eine sogenannte End-of-production-Zellbank (E-o-P-Zellbank) angelegt. Dabei muss bedacht werden, dass ein Verlust des angezeigten Saatgutsystems oder der Verbrauch des auf Vorrat gehaltenen Master-Seed nur durch erneut validierte und genehmigte Zellbanken ersetzt werden kann.
Nach dem Gentechnikgesetz (GenTG) werden über den Wirt oder Produzenten Angaben zu der eindeutigen taxonomischen Charakterisierung sowie Angaben zu der gentechnischen Veränderung verlangt. Weitere vorgeschriebene Angaben sind, ob natürlicherweise Plasmide oder endogene Viren vorkommen, und ob mit toxischen, mutagenen, karzinogenen oder allergenen Wirkungen des Wirtes zu rechnen ist. Zum Schutze des Menschen und der Umwelt verlangt das GenTG ferner, dass anzugeben ist, welches Risiko für Tiere oder Pflanzen bei nicht beabsichtigter Freisetzung besteht. Im Rahmen des Betriebs- und Produktionsablauf muss beschrieben werden, wie der Wirtsorganismus möglicherweise übertragen werden kann, wie hoch die Mindestinfektionsdosis bei bekanntem Applikationsweg ist, welche Notfalltherapeutika oder Impfstoffe bevorratet sein müssen, und wie Dekontaminationen oder Desinfektionen durchzuführen sind.
Nach Entnahme und Anzucht zu einer Arbeitskultur auf festen Agar (Mikroorganismen) oder in flüssiger Kultur (Mikroorganismen und Säugerzellen) erfolgt sukzessives Scaling Up vom Schüttelkolben über den Laborfermenter zum industriellen Bioreaktor. Scaling Up erfolgt nach Erfahrungswerten in dekadischen Schritten, beispielsweise von einem Inokulum mit 30 ml Volumen über 300-ml-Erlenmeyerkolben und 3- bzw. 30-l-Laborfermenter zu 300-l-Industriefermentern.
Vektorsysteme