mini|sgRNA bei Cas9 (grün) mini|Basenpaarung zwischen der sgRNA und Zielsequenz mini|Arbeitsschritte beim Entwurf einer sgRNA Single Guide RNA (sgRNA) ist eine künstliche RNA, die in der CRISPR/Cas-Methode, der CRISPRi oder der CRISPRa in Kombination mit Cas9 oder Cas12b verwendet wird.
Eigenschaften Die sgRNA bildet eine Sekundärstruktur, die als R-loop bezeichnet wird.F. Jiang, D. W. Taylor, J. S. Chen, J. E. Kornfeld, K. Zhou, A. J. Thompson, E. Nogales, J. A. Doudna: Structures of a CRISPR-Cas9 R-loop complex primed for DNA cleavage. In: Science. Band 351, Nummer 6275, Februar 2016, S. 867–871, , PMID 26841432, . Sie kann in Bakterien,W. Jiang, D. Bikard, D. Cox, F. Zhang, L. A. Marraffini: RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. In: Nature Biotechnology. Band 31, Nummer 3, März 2013, S. 233–239, , PMID 23360965, .J. M. Peters, A. Colavin, H. Shi, T. L. Czarny, M. H. Larson, S. Wong, J. S. Hawkins, C. H. Lu, B. M. Koo, E. Marta, A. L. Shiver, E. H. Whitehead, J. S. Weissman, E. D. Brown, L. S. Qi, K. C. Huang, C. A. Gross: A Comprehensive, CRISPR-based Functional Analysis of Essential Genes in Bacteria. In: Cell. Band 165, Nummer 6, Juni 2016, S. 1493–1506, , PMID 27238023, .X. T. Li, Y. Jun, M. J. Erickstad, S. D. Brown, A. Parks, D. L. Court, S. Jun: tCRISPRi: tunable and reversible, one-step control of gene expression. In: Scientific Reports. Band 6, 12 2016, S. 39076, , PMID 27996021, . Hefen,J. E. DiCarlo, J. E. Norville, P. Mali, X. Rios, J. Aach, G. M. Church: Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. In: Nucleic acids research. Band 41, Nummer 7, April 2013, S. 4336–4343, , PMID 23460208, . Fruchtfliegen,G. W. Thickbroom, F. L. Mastaglia: Cerebral events preceding self-paced and visually triggered saccades. A study of presaccadic potentials. In: Electroencephalography and clinical neurophysiology. Band 62, Nummer 4, Juli 1985, S. 277–289, , PMID 2408874. ZebrafischenW. Y. Hwang, Y. Fu, D. Reyon, M. L. Maeder, S. Q. Tsai, J. D. Sander, R. T. Peterson, J. R. Yeh, J. K. Joung: Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. In: Nature Biotechnology. Band 31, Nummer 3, März 2013, S. 227–229, , PMID 23360964, ., MäusenH. Wang, H. Yang, C. S. Shivalila, M. M. Dawlaty, A. W. Cheng, F. Zhang, R. Jaenisch: One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. In: Cell. Band 153, Nummer 4, Mai 2013, S. 910–918, , PMID 23643243, . und Menschen verwendet werden. Daraufhin wird sie von Cas-Proteinen des Typs I und II gebunden. Natürlicherweise bindet Cas9 zwei RNAs, die crRNA und die tracrRNA, während bei der Methode nur eine aus Sequenzen der beiden RNAs bestehende (einkettige) sgRNA verwendet wird.M. Jinek, K. Chylinski, I. Fonfara, M. Hauer, J. A. Doudna, E. Charpentier: A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. In: Science. Band 337, Nummer 6096, August 2012, S. 816–821, , PMID 22745249, . Dadurch muss für die CRISPR/Cas-Methode nur eine DNA synthetisiert werden, die als Template der sgRNA dient. Eine sgRNA besteht aus den 20 Nukleotiden strangaufwärts (in 5'-Richtung) von einem Protospacer Adjacent Motif (PAM) der zu schneidenden Ziel-DNA und einem Teil der tracrRNA. Bevorzugt befindet sich am 5'-Ende der 20 Nukleotide (Position 1) ein Guaninnukleotid (GC-clamp) und vier Nukleotide vor dem PAM (Position 17) ein Adenin- oder Thyminnukleotid. Programme zur Identifikation von 20 Nukleotiden vor einem PAM bzw. zum Entwerfen einer sgRNA sind beispielsweise CHOPCHOP, CasOFFinder, FlyCRISPR, CRISPR-ERA, SgRNA Designer, CRISPOR, E-CRISP und CRISPRdirect.S. E. Mohr, Y. Hu, B. Ewen-Campen, B. E. Housden, R. Viswanatha, N. Perrimon: CRISPR guide RNA design for research applications. In: The FEBS journal. Band 283, Nummer 17, 09 2016, S. 3232–3238, , PMID 27276584, .
Meistens werden zum Einschleusen der sgRNA in eukaryotische Zellen virale Vektoren transduziert oder Plasmide transfiziert. Bei Verwendung zur Gentherapie in Eukaryoten wird ein eukaryotischer Promotor verwendet. Im Falle einer Einschleusung des Cas-Proteins und der sgRNA in eine Zelle wird die sgRNA vorher durch eine In-vitro-Transkription erzeugt. Dies geschieht beispielsweise mittels eines T7-Promotors im DNA-Template und der T7-RNA Polymerase.
Weblinks How to Design Your gRNA for CRISPR Genome Editing, abgerufen am 29. Januar 2019.
Einzelnachweise
Kategorie:RNA Kategorie:Nukleinsäure-Methode