Nylonase ist der populärwissenschaftliche Name für eine Klasse von drei Enzymen, die in der Lage sind, die Hydrolyse von Oligomeren der 6-Aminohexansäure (Ahx) zu katalysieren. Die Enzyme konnten aus mehreren Bakterienarten isoliert werden. Der wissenschaftlich korrekte Name für diese Enzyme ist 6-Aminohexanoatoligomerhydrolasen. Sie werden zu den Amidasen gezählt, die wiederum eine Untergruppe der Hydrolasen bilden. Die Substrate für diese Enzyme, die Oligomere der 6-Aminohexansäure, gibt es auf der Erde erst seit dem Jahr 1938. Sie entstehen als Nebenprodukte bei der großtechnischen Herstellung von Polyamid 6 (Perlon) und gelangen so in die Umwelt. Nach dem vorherrschenden naturwissenschaftlichen Konsens erwarben die mit diesen Enzymen ausgestatteten Bakterien die Fähigkeit zur Verdauung der Polyamid-6-Nebenprodukte durch evolutionäre Prozesse. Für Evolutionsbiologen ist die Entwicklung der Nylonasen durch Bakterien ein Paradebeispiel der beobachtbaren Evolution.

Polyamid 6

Polyamid 6 (PA6), auch Nylon 6 genannt und besser bekannt unter der Handelsmarke Perlon, wurde erstmals am 29. Januar 1938 von dem deutschen Chemiker Paul Schlack in den Laboren der Forschungsabteilung der Aceta GmbH in Berlin-Lichtenberg hergestellt. Für die Synthese von PA6 nahm Schlack das heute noch dafür verwendete ε-Caprolactam als Ausgangsmaterial. Die Polymerisation geht von 6-Aminohexansäure (Ahx) aus, die aus ε-Caprolactam und Wasser entsteht. rahmenlos|300px|klasse=skin-invert-image|Bildung von 6-Aminohexansäure durch Hydrolyse von ε-Caprolactams Bildung von 6-Aminohexansäure durch Hydrolyse von ε-Caprolactam

Die 6-Aminohexansäure reagiert dann unter Amidbildung mit einem Molekül ε-Caprolactam zu einem Dimer, dem N-(6-Aminohexanoyl)-6-aminohexanoat, kurz (Ahx2) genannt. rahmenlos|300px|klasse=skin-invert-image|Reaktion von 6-Aminohexansäure mit ε-Caprolactam zu Ahx2 Reaktion von 6-Aminohexansäure mit ε-Caprolactam zu Ahx2

Dieses wiederum kann mit einem weiteren Molekül ε-Caprolactam zu einem Trimer reagieren. Die Polymerisationsreaktion kann so durch Anlagerung weiterer ε-Caprolactam-Moleküle voranschreiten. Polyamid 6 besteht im Wesentlichen aus über 100 miteinander verknüpften Aminohexansäureeinheiten. rahmenlos|200px|klasse=skin-invert-image|Die Struktur von Polyamid 6 Die Struktur von Polyamid 6. Der Buchstabe n steht hierbei für die Anzahl der miteinander verknüpften Einheiten an 6-Aminohexansäure. Der Polymerisationsgrad liegt im Mittel bei n=100.

Die Polymerisation ist jedoch ein weitgehend unkontrolliert ablaufender Prozess, der in einer relativ breiten Verteilung der Molmassen resultiert. So finden sich im Polymerisat auch niedermolekulare Verbindungen (Oligomere), wie beispielsweise Dimere (Ahx2), Trimere (Ahx3) usw., der 6-Aminohexansäure. Durch Kopf-Schwanz-Verknüpfung können auch zyklische Oligomere wie beispielsweise 1,8-Diazacyclotetradecan-2,9-dion entstehen. Diese Oligomere sind unerwünschte Nebenprodukte der Polyamid-6-Produktion. mini|1,8-Diazacyclotetradecan-2,9-dion, ein zyklisches Dimer der Aminohexansäure, ist eines der Nebenprodukte der Polyamid-6-Produktion. Die Abwässer der Produktionsbetriebe von Polyamid 6 enthalten neben ε-Caprolactam und 6-Aminohexansäure auch die linearen und zyklischen Oligomere von Polyamid 6. Die Löslichkeit der linearen Oligomere nimmt mit zunehmender Kettenlänge ab. Das Trimer Ahx3 ist zu 1,8 %, das Tetramer Ahx4 zu 0,3 % und das Pentamer Ahx5 nur noch zu 0,01 % in Wasser löslich. Das Hexamer Ahx6 ist in Wasser so gut wie unlöslich. Während des Produktionsprozesses werden die Oligomere mit heißem Wasser vom gewünschten Produkt abgetrennt und gelangen so auch ins Abwasser. Beim Abkühlen des Waschwassers fällt ein Großteil der Nebenprodukte als Feststoff aus. Abhängig von der Prozessführung und der Größe der Produktionsanlage fallen so pro Jahr zwischen 20 und 180 Tonnen Oligomere und ε-Caprolactam für einen Betrieb an. Diese Produktionsabfälle werden häufig durch Vergraben in Deponien entsorgt. Weltweit werden pro Jahr etwa 4 Millionen Tonnen Polyamid 6 produziert (Stand 2010).

„Normale“ Mikroorganismen sind nicht in der Lage, die Nebenprodukte der Polyamid-6-Produktion abzubauen. Sie können im Wesentlichen nur peptidische Bindungen von α-Aminosäuren mit Hilfe von Peptidasen spalten. Amidbindungen in ε-Position sind erst seit den Versuchen von Schlack bzw. beim Polyamid 6.6 seit dem 28. Februar 1935 durch Wallace Hume Carothers bekannt.

Nylonasen und die sie produzierenden Bakterien 1965 isolierte der Japaner Takashi Fukumura aus dem Abwasser eines Polyamid-6-produzierendes Betriebes der Firma Toyo Rayon Co., Ltd. (heute Toray) in Nagoya elf verschiedene Bakterienstämme, die in der Lage waren in einem Nährmedium mit 0,6 % ε-Caprolactam zu wachsen. Ein Bakterienstamm (Corynebacterium aurantiacum) konnte darüber hinaus lineare und zyklische Oligomere von 6-Aminohexansäure – mit Ausnahme des zyklischen 6-Aminohexansäure-Dimers – verstoffwechseln (metabolisieren). Vier Jahre nach Fukumura isolierte eine andere japanische Arbeitsgruppe aus dem gleichen Umfeld ein Bakterium aus der Gattung der Pseudomonaden, das in der Lage ist auch zyklische Oligomere von 6-Aminohexansäure zu metabolisieren. Eine Arbeitsgruppe um Hirosuke Okada isolierte 1974 aus Klärschlamm den Bakterienstamm KI72 von Flavobacterium sp.,Das Bakterium wurde ursprünglich von den Autoren als Achromobacter guttatus klassifiziert. der in der Lage ist, mit dem zyklischen Dimer von 6-Aminohexansäure als einziger Kohlenstoff- und Stickstoffquelle zu gedeihen. Der zwei Jahre zuvor von derselben Arbeitsgruppe isolierte Stamm KF71 des Flavobakteriums konnte dies nicht. KI72 ist in der Lage, ε-Caprolactam, 6-Aminohexansäure und das zyklische Ahx-Dimer sowie die linearen Di- bis Hexamere von 6-Aminohexansäure zu metabolisieren. Aus dem Bakterium isolierten die Forscher zwei Enzyme, von denen eines die Hydrolyse des zyklischen 6-Aminohexansäure-Dimers zu Ahx2 katalysiert. Das andere Enzym katalysiert die Hydrolyse der linearen Oligomere. Das Enzym, das das zyklische 6-Aminohexansäure-Dimer spalten kann, wurde auf seine hydrolytischen Fähigkeiten gegenüber anderen, natürlichen Substraten getestet. Überraschenderweise konnte es bei keinem der 50 Dipeptide und 16 Tripeptide die Hydrolyse katalysieren. In nachfolgenden Versuchen erhöhte sich die Zahl der natürlichen Verbindungen mit Amidbindung, die kein Substrat für dieses NylA genannte Enzym bilden, auf über 100. Auch für das Enzym, das als Substrat die linearen Oligomere hat und heute NylB genannt wird, konnte kein „natürliches“ Substrat gefunden werden.

Das Zelllysat, das von Zellen erhalten wurde deren Nährmedium kein zyklisches Dimer enthielt, war nicht in der Lage die Hydrolyse des zyklischen Dimers zu katalysieren. Im Gegensatz zu dem Zelllysat das von Zellen mit zyklischem Dimer als Nährmedium erhalten wurde. Okada und seine Mitautoren schlossen aus diesem Verhalten, dass die 6-Aminohexansäure-Dimer-Hydrolase, ein induzierbares Enzym ist, das heißt, dass die Konzentration des Enzyms durch die Anwesenheit eines Induktors – in diesem Fall des zyklischen Dimers – erhöht wird.

Es gibt zwei mögliche Ursachen dafür, warum ein Enzym eine Aktivität gegenüber einem unnatürlichen Substrat aufweist. Im ersten, einfacheren Fall ist das unnatürliche Substrat ein Analogon zum natürlichen Substrat. Im zweiten Fall wird die Katalyse durch ein evolutionär entwickeltes Enzym bewerkstelligt, das seine ursprüngliche Aktivität gegenüber einem natürlichen Substrat durch Mutation verloren hat. Da Okada und seine Mitautoren in ihren Versuchen kein natürliches Substrat für die 6-Aminohexansäure-Dimer-Hydrolase fanden und dieses Enzym im Vergleich zu anderen zyklischen Amidhydrolasen, wie beispielsweise Penicillinase (>35 s−1), eine vergleichsweise niedrige katalytische Konstante kcat (8 s−1) aufweist, schlossen sie, dass die 6-Aminohexansäure-Dimer-Hydrolase wahrscheinlich durch evolutionäre Anpassung entstanden ist.

1992 isolierte Seiji Negoro mit weiteren Kollegen aus Okadas Arbeitsgruppe ein drittes Enzym, heute NylC genannt, aus dem Bakterienstamm. NylC ist eine Endohydrolase, das bedeutet, dass das Enzym die Hydrolyse im Inneren ( endon ‚innen‘) der Oligomerkette katalysiert. Gegenüber dem zyklischen Dimer hat es keine Aktivität, aber gegenüber dem zyklischen Tetramer und Pentamer. Auch bei NylC konnte keine Aktivität gegenüber „natürlichen“ Amidbindungen festgestellt werden.

Für den Abbau der 6-Aminohexansäure-Oligomere sind somit insgesamt drei Enzyme verantwortlich: zyklische 6-Aminohexansäure-Dimer-Hydrolase (NylA) 6-Aminohexansäure-Dimer-Hydrolase (NylB) 6-Aminohexanoat-Oligomer-Endohydrolase (NylC)

mini|hochkant=2.6|Schematische Darstellung des Abbaus von Polyamid-6-Oligomeren durch die drei Nylonasen.

Vergleich der Eigenschaften der drei Polyamid-6-abbauenden Enzyme von Flavobacterium sp. KI72: EigenschaftenEnzym Gen nylA nylB nylC Molare Masse 52 kDa 42 kDa 37 kDa Anzahl an Aminosäuren 493 392 355 optimaler pH-Wert 7,4 9,0 7,0 Temperaturoptimum 34 °C 40 °C 42 °CSpezifische Aktivität gegenüber Ahx2 (lineares Dimer) <0,001 0,94 0,00044 Ahx3 (lineares Trimer) <0,001 0,75 0,11 Ahx4 (lineares Tetramer) <0,001 0,57 0,42 Ahx5 (lineares Pentamer) <0,001 0,24 0,47 cyclo(Ahx)2 (zyklisches Dimer) 2,8 <0,0001 <0,0001 cyclo(Ahx)4 (zyklisches Tetramer) <0,001 <0,0001 0,36 ε-Caprolactam <0,001 <0,0001 <0,0001 Die Aktivitätswerte wurden bei einer Substratkonzentration von 1 mM erhalten und sind in mol NH2 pro min und mg aufgereinigtem Protein (U/mg) angegeben. Bei den grün hinterlegten Werten ist eine signifikante Aktivität gegenüber dem jeweiligen Substrat gegeben.

NylA mini|Bändermodell von NylA. Die zyklische 6-Aminohexansäure-Dimer-Hydrolase (NylA) katalysiert spezifisch die Hydrolyse einer der beiden äquivalenten Amidbindungen in 1,8-Diazacyclotetradecan-2,9-dion, dem zyklischen Dimer der 6-Aminohexansäure. Dabei entsteht N-(6-Aminohexanoyl)-6-aminohexanoat, das lineare Dimer der 6-Aminohexansäure. NylA gehört zur Amidase-Signatur-Familie (engl. ). Die Mitglieder dieser über 200 Enzyme umfassenden Familie haben einen konservierten Sequenzbereich von 160 Aminosäuren, die Amidase-Signatur. Gegenüber anderen Polyamid-6-Oligomeren weist NylA so gut wie keine Aktivität auf.

NylB mini|links|Bändermodell von NylB mit D370Y-Mutation Die 6-Aminohexansäure-Dimer-Hydrolase (NylB) hat in ihrem aktiven Zentrum die katalytische Triade Ser112/Lys115/Tyr215 und ein Oxyanion-Loch. Die katalytische Triade entspricht der einiger anderer bakterieller Serinhydrolasen, wie beispielsweise D-Alanin-Transpeptidase, Carboxylesterase 2 (estB) und Klasse C Serin-β-Lactamasen. Ein wesentlicher Unterschied ist jedoch die Aminosäure Tyrosin in Position 170 (Tyr170), die sich so bei keiner Serin-β-Lactamasen findet. Tyr170 hat durch seine Interaktion mit der katalytischen Triade einen wesentlichen Anteil an der Fähigkeit von NylB die Hydrolyse von Ahx2 zu katalysieren. Die Substratbindung im Enzym wird durch Tyr170 erhöht. Außerdem fördert Tyr170 im Enzym – durch Störung eines tetraedrischen Übergangszustand – eine Konformationsänderung des Substrates, die günstig für dessen Protonierung durch Tyr215 von der katalytischen Triade ist. Wird das Tyrosin in Position 170 durch das sterisch sehr ähnliche Phenylalanin ersetzt (Tyr170Phe), so sinkt die Aktivität von NylB gegenüber Ahx2 auf 1,4 %.

Die Aktivität von NylB gegenüber linearen Polyamid-6-Oligomeren nimmt mit zunehmender Kettenlänge deutlich ab. Beim Hexamer (Ahx6) beträgt die Aktivität nur noch 8 % des Wertes vom Dimer (Ahx2), beim Eikosamer (Ahx20) sinkt der Wert auf 0,3 %.

Wie andere Serinproteasen zeigt NylB auch Eigenschaften einer Esterase und ist in der Lage die Hydrolyse verschiedener Carbonsäureester zu katalysieren.

NylB′