mini|Schema der Verwendung von TALEN
Eine (dt. ‚transkriptionsaktivatorartige Effektornuklease‘, TALEN) ist ein künstliches sequenzspezifisches Restriktionsenzym, das auf der Tal-effector-Domäne basiert.
Die Funktionsweise der Domäne wurde 2009 anhand des Effektorproteins AvrBs3 erstmals beschrieben.
Eigenschaften sind Fusionsproteine aus einer -DNA-bindenden Domäne und einer Endonukleasedomäne. Durch die im Zuge eines Proteindesigns eingesetzte DNA-bindende Domäne erfolgt die sequenzspezifische Bindung, durch die Endonuklease ein vergleichsweise wenig sequenzspezifischer Schnitt. TALENs sind neben der CRISPR/Cas-Methode und Zinkfingernukleasen Methoden des Genome Editing.
Die Tal effector-Domäne stammt ursprünglich aus Xanthomonas-Bakterien und besitzt eine konservierte Sequenz von 33 bis 34 Aminosäuren. Die Positionen 12 und 13 sind dagegen variabel () und sind für die Erkennung von Nukleotiden in DNA verantwortlich. Eine mangelnde Spezifität der Tal effector-Domäne führt zu Doppelstrangbrüchen an anderen DNA-Sequenzen.
Für eine Verwendung in Hefen, pflanzlichen oder tierischen Zellen wird meistens die Endonukleasedomäne von FokI verwendet.M. Christian, T. Cermak, E. L. Doyle, C. Schmidt, F. Zhang, A. Hummel, A. J. Bogdanove, D. F. Voytas: Targeting DNA double-strand breaks with TAL effector nucleases. In: Genetics. Band 186, Nummer 2, Oktober 2010, , S. 757–761, doi:10.1534/genetics.110.120717. PMID 20660643, .T. Li, S. Huang, W. Z. Jiang, D. Wright, M. H. Spalding, D. P. Weeks, B. Yang: TAL nucleases (TALNs): hybrid proteins composed of TAL effectors and FokI DNA-cleavage domain. In: Nucleic acids research. Band 39, Nummer 1, Januar 2011, , S. 359–372, doi:10.1093/nar/gkq704. PMID 20699274, .M. M. Mahfouz, L. Li, M. Shamimuzzaman, A. Wibowo, X. Fang, J. K. Zhu: De novo-engineered transcription activator-like effector (TALE) hybrid nuclease with novel DNA binding specificity creates double-strand breaks. In: Proceedings of the National Academy of Sciences. Band 108, Nummer 6, Februar 2011, , S. 2623–2628, doi:10.1073/pnas.1019533108. PMID 21262818, .T. Cermak, E. L. Doyle, M. Christian, L. Wang, Y. Zhang, C. Schmidt, J. A. Baller, N. V. Somia, A. J. Bogdanove, D. F. Voytas: Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting. In: Nucleic acids research. Band 39, Nummer 12, Juli 2011, S. e82, . doi:10.1093/nar/gkr218. PMID 21493687. .D. Hockemeyer, H. Wang, S. Kiani, C. S. Lai, Q. Gao, J. P. Cassady, G. J. Cost, L. Zhang, Y. Santiago, J. C. Miller, B. Zeitler, J. M. Cherone, X. Meng, S. J. Hinkley, E. J. Rebar, P. D. Gregory, F. D. Urnov, R. Jaenisch: Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. In: Nature Biotechnology. Band 29, Nummer 8, August 2011, S. 731–734, . doi:10.1038/nbt.1927. PMID 21738127. .A. J. Wood, T. W. Lo, B. Zeitler, C. S. Pickle, E. J. Ralston, A. H. Lee, R. Amora, J. C. Miller, E. Leung, X. Meng, L. Zhang, E. J. Rebar, P. D. Gregory, F. D. Urnov, B. J. Meyer: Targeted genome editing across species using ZFNs and TALENs. In: Science. Band 333, Nummer 6040, Juli 2011, S. 307, . doi:10.1126/science.1207773. PMID 21700836. . Während ursprünglich der Wildtyp von FokI verwendet wurde, sind nachfolgend verschiedene Mutationen zur Verbesserung der SpezifitätY. Doyon, T. D. Vo, M. C. Mendel, S. G. Greenberg, J. Wang, D. F. Xia, J. C. Miller, F. D. Urnov, P. D. Gregory, M. C. Holmes: Enhancing zinc-finger-nuclease activity with improved obligate heterodimeric architectures. In: Nature methods. Band 8, Nummer 1, Januar 2011, S. 74–79, . doi:10.1038/nmeth.1539. PMID 21131970.M. Szczepek, V. Brondani, J. Büchel, L. Serrano, D. J. Segal, T. Cathomen: Structure-based redesign of the dimerization interface reduces the toxicity of zinc-finger nucleases. In: Nature Biotechnology. Band 25, Nummer 7, Juli 2007, S. 786–793, . doi:10.1038/nbt1317. PMID 17603476. und AktivitätJ. Guo, T. Gaj, C. F. Barbas: Directed evolution of an enhanced and highly efficient FokI cleavage domain for zinc finger nucleases. In: Journal of molecular biology. Band 400, Nummer 1, Juli 2010, S. 96–107, . doi:10.1016/j.jmb.2010.04.060. PMID 20447404. . in FokI eingeführt worden. FokI ist ein dimeres Protein, und die Anzahl an Basenpaaren zwischen der Tal effector-Domäne und den beiden FokI-Untereinheiten wirkt sich auf die Aktivität aus.C. Mussolino, R. Morbitzer, F. Lütge, N. Dannemann, T. Lahaye, T. Cathomen: A novel TALE nuclease scaffold enables high genome editing activity in combination with low toxicity. In: Nucleic acids research. Band 39, Nummer 21, November 2011, S. 9283–9293, . doi:10.1093/nar/gkr597. PMID 21813459. .
Die DNA-Sequenz des entworfenen TALEN-Fusionsproteins wird in ein Plasmid kloniert und anschließend in die Zielzellen transfiziert. Das Gen wird in der Zelle in das Protein übersetzt und durch die enthaltene Signalsequenz in den Zellkern eingeschleust, wo es seine Aktivität entfaltet.
Medizinische Nutzung 2015 wurde eine experimentelle TALEN-basierte Gentherapie dazu genutzt, eine einjährige Patientin von Leukämie zu heilen. Dies war das erste Mal, dass Genome Editing erfolgreich zur Heilung einer akut tödlichen Krankheit eingesetzt wurde.
Weblinks E-TALEN.org Programm zum Entwurf von TALEN TALengineering.org TAL effector Technologie www.taleffectors.com TAL effector-Konstrukte
Einzelnachweise
Kategorie:Nuklease Kategorie:Gentechnik Kategorie:Nukleinsäure-Methode