(auch , deutsch: isothermaler Zusammenbau nach Gibson) ist eine biochemische Methode zur Erzeugung und Vervielfältigung von DNA.D. G. Gibson, L. Young, R. Y. Chuang, J. C. Venter, C. A. Hutchison, H. O. Smith: Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. In: Nature methods. Band 6, Nummer 5, Mai 2009, , S. 343–345, , PMID 19363495.D. G. Gibson, H. O. Smith, C. A. Hutchison, J. C. Venter, C. Merryman: Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. In: Nature methods. Band 7, Nummer 11, November 2010, , S. 901–903, , PMID 20935651. Sie ist eine Variante der isothermen DNA-Amplifikation. In Kombination mit einem partiellen Exonuklease-Verdau wird sie zur Klonierung verwendet.
Prinzip thumb|upright=1.5|Verbinden zweier DNA-Fragmente mittels Gibson assembly. Die Gibson assembly läuft bei einer gleichbleibenden Temperatur ab (isothermal). Die aneinanderzufügenden DNA-Doppelstränge müssen bei einer isothermal assembly überlappende DNA-Sequenzen aufweisen. Die T5-Exonuklease verdaut die 5'-Enden eines DNA-Doppelstrangs teilweise, wodurch die überhängenden zweiten Stränge als sticky ends eine Hybridisierung der homologen einzelsträngigen Bereiche der DNA-Sequenzen einleiten.D. G. Gibson: Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. In: Methods in enzymology. Band 498, 2011, , S. 349–361, , PMID 21601685. Weiterhin wird eine DNA-Polymerase mit DNA-Doppelstrang-trennenden Eigenschaften verwendet, die während der Synthese eines zweiten DNA-Strangs den vorliegenden Doppelstrang auftrennt und den bestehenden zweiten Strang verdrängt. Hierbei kann die φ29-DNA-Polymerase oder das bei 65 °C thermostabile große Fragment der Bst-DNA-Polymerase aus Bacillus stearothermophilus verwendet werden. Eine Ligase kann verwendet werden, um die erzeugten DNA-Sequenzen bereits in vitro miteinander zu verbinden.
Im Vergleich zu den verschiedenen Varianten der Polymerase-Kettenreaktion eignet sich diese Methode besonders für die Vermehrung von langen DNA-Sequenzen (mehr als 2.000 bis 100.000 Basenpaare). Ein weiterer Vorteil ist, dass es bei Gemischen von DNA durch diese Art der Amplifikation keine Verzerrung (engl. Bias) gibt, d. h., dass bei Gemischen nicht einzelne DNA-Sequenzen bevorzugt werden bzw. andere benachteiligt. Alternative isothermale Verfahren zur Vermehrung von DNA sind z. B. die , die , die (LAMP), die helicase-dependent amplification (HDA) und die (NEAR). Alternative Verfahren zur gezielten Erzeugung neuer DNA-Sequenzen sind neben den drei von Gibson beschriebenen Verfahren z. B. die Fusions-PCR,W. P. Stemmer, A. Crameri, K. D. Ha, T. M. Brennan, H. L. Heyneker: Single-step assembly of a gene and entire plasmid from large numbers of oligodeoxyribonucleotides. In: Gene. Band 164, Nummer 1, Oktober 1995, , S. 49–53, PMID 7590320. die Polymerase Cycling Assembly (PCA),H. O. Smith, C. A. Hutchison, C. Pfannkoch, J. C. Venter: Generating a synthetic genome by whole genome assembly: phiX174 bacteriophage from synthetic oligonucleotides. In: Proceedings of the National Academy of Sciences. Band 100, Nummer 26, Dezember 2003, , S. 15440–15445, , PMID 14657399, . das circular polymerase extension cloning (CPEC)J. Quan, J. Tian: Circular polymerase extension cloning of complex gene libraries and pathways. In: PloS one. Band 4, Nummer 7, 2009, S. e6441, , , PMID 19649325, . oder die homologe Rekombination in vivo.
Anwendungen Die Gibson Assembly wird unter anderem zur Klonierung und in der synthetischen Biologie zur Amplifikation von DNA verwendet.T. Ellis, T. Adie, G. S. Baldwin: DNA assembly for synthetic biology: from parts to pathways and beyond. In: Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. Band 3, Nummer 2, Februar 2011, , S. 109–118, , PMID 21246151.
Einzelnachweise
Kategorie:Molekularbiologie Kategorie:Nukleinsäure-Methode Kategorie:Gentechnik