mini|CRISPR/Cas-Komplex mit DNA Die CRISPR/Cas-Methode (von englisch Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats – gruppierte kurze palindromische Wiederholungen mit regelmäßigen Abständen und CRISPR-associated – CRISPR-assoziiertes Protein) ist eine molekularbiologische Methode, um DNA gezielt zu schneiden und zu verändern (Genome Editing). Gene können mit dem CRISPR/Cas-System eingefügt, entfernt oder ausgeschaltet werden, auch Nukleotide in einem Gen können geändert werden.H. Ochiai: Single-Base Pair Genome Editing in Human Cells by Using Site-Specific Endonucleases. In: International journal of molecular sciences. Band 16, Nummer 9, 2015, S. 21128–21137, doi:10.3390/ijms160921128, PMID 26404258, (Review). Aufgrund der einfachen Durchführung, der Skalierbarkeit hinsichtlich unterschiedlicher Zielsequenzen und der geringen Kosten wird die CRISPR/Cas-Methode zunehmend in der Forschung eingesetzt.M. M. Mahfouz, A. Piatek, C. N. Stewart: Genome engineering via TALENs and CRISPR/Cas9 systems: challenges and perspectives. In: Plant biotechnology journal. Band 12, Nummer 8, Oktober 2014, S. 1006–1014, doi:10.1111/pbi.12256, PMID 25250853.E. Pennisi: The CRISPR craze. In: Science. Band 341, Nummer 6148, August 2013, S. 833–836, doi:10.1126/science.341.6148.833, PMID 23970676. Gleichzeitig gibt es beim aktuellen Stand der Forschung noch Probleme bei der Spezifität durch off-target-Effekte, also Auswirkungen am Genom außerhalb der Schnittstelle.
Die wissenschaftliche Grundlage zur Entwicklung der CRISPR/Cas-Methode wurde durch die Entdeckung und Erforschung der CRISPR-Sequenzen und des damit verbundenen CRISPR/Cas-Systems im Immunsystem verschiedener Bakterien und Archaea gelegt. Die erste wissenschaftliche Dokumentation zur Entwicklung und zum Einsatz der Methode wurde 2012 durch eine Arbeitsgruppe um Emmanuelle Charpentier und Jennifer Doudna veröffentlicht. Die wissenschaftliche Fachzeitschrift Science erklärte die CRISPR-Methode zum Breakthrough of the Year 2015. Für ihre Arbeiten an der CRISPR/Cas-Methode wurden die beiden Wissenschaftlerinnen mit dem Nobelpreis für Chemie 2020 ausgezeichnet.
Prinzip mini|Überblick der drei Phasen des CRISPR/Cas9-Prozesses als AbwehrmechanismusJennifer Doudna, Emmanuelle Charpentier.: The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science 346(6213):1077 (2014), PMID 25430774, doi:10.1126/science.1258096. Die CRISPR/Cas-Methode basiert auf einem adaptiven antiviralen Abwehrmechanismus von Bakterien, dem CRISPR.R. Sorek, V. Kunin, P. Hugenholtz: CRISPR–a widespread system that provides acquired resistance against phages in bacteria and archaea. In: Nature reviews. Microbiology. Band 6, Nummer 3, März 2008, S. 181–186, . doi:10.1038/nrmicro1793. PMID 18157154.D. Rath, L. Amlinger, A. Rath, M. Lundgren: The CRISPR-Cas immune system: biology, mechanisms and applications. In: Biochimie. Band 117, Oktober 2015, S. 119–128, doi:10.1016/j.biochi.2015.03.025, PMID 25868999 (Review). Sie wird als Methode verwendet, um DNA an einer bestimmbaren DNA-Sequenz zu schneiden. Dadurch können beispielsweise durch zwei Schnitte DNA-Sequenzen entfernt – oder es kann im Anschluss an einen Schnitt eine andere DNA-Sequenz an der Schnittstelle eingefügt werden.
Das DNA-schneidende Enzym namens Cas (von CRISPR-associated‚ CRISPR-assoziiert‘) bindet eine bestimmte RNA-Sequenz. Auf diese RNA-Sequenz folgt eine weitere RNA-Sequenz, die per Basenpaarung an eine DNA mit komplementärer Sequenz binden kann. Die RNA dient hierbei als Brücke zwischen Cas und der zu schneidenden DNA. Durch die Verkettung des Enzyms Cas, der RNA und der DNA wird das DNA-schneidende Enzym Cas in die räumliche Nähe der gebundenen DNA gebracht, woraufhin das Enzym die (indirekt gebundene) DNA schneidet. Im Sonderfall einer Einfügung von DNA in die Schnittstelle wird eine weitere DNA hinzugegeben, die an ihren beiden Enden jeweils überlappende Sequenzen für eines der beiden Enden der Schnittstelle aufweist. Die einzufügende DNA wird durch die zelleigene DNA-Reparatur mit den Enden der Schnittstelle verbunden. Bei einer Variante des Systems (Prime Editing) ist keine einzufügende DNA für eine Einfügung nötig, da die einzufügende Sequenz durch eine RNA-Verlängerung codiert wird.
Eigenschaften mini|3D-Struktur des CRISPR-Cas9-Komplexes mini|CRISPR-Cas9 kann als molekulares Werkzeug gezielt DNA-Doppelstrangbrüche einführen mini|Die durch CRISPR-Cas9 gezielt eingeführten DNA-Doppelstrangbrüche eröffnen den Weg zu genetischer Manipulation Cas-Proteine können als Ribonukleoproteine bestimmte RNA-Sequenzen binden. Die Endonuklease Cas9 (veraltet auch Cas5, Csn1 oder Csx12) kann eine bestimmte RNA-Sequenz (crRNA repeat, Sequenz GUUUUAGAGCU(A/G)UG(C/U)UGUUUUG)G. Gasiunas, R. Barrangou, P. Horvath, V. Siksnys: Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. In: Proceedings of the National Academy of Sciences. Band 109, Nummer 39, September 2012, S. E2579–E2586, . doi:10.1073/pnas.1208507109. PMID 22949671. . binden und in der unmittelbaren Umgebung DNA schneiden. In Bakterien folgt auf die crRNA repeat-Sequenz eine crRNA-spacer-Sequenz, die an die Ziel-DNA bindet. Beide Teile werden zusammen als crRNA bezeichnet. Die crRNA-spacer-Sequenz dient in der Funktion eines variablen Adapters, die komplementär zur Ziel-DNA ist und an die Ziel-DNA bindet. Die crRNA-repeat-Sequenz bildet eine RNA-Sekundärstruktur und wird dann von Cas9 gebunden,V. Kunin, R. Sorek, P. Hugenholtz: Evolutionary conservation of sequence and secondary structures in CRISPR repeats. In: Genome biology. Band 8, Nummer 4, 2007, S. R61, . doi:10.1186/gb-2007-8-4-r61. PMID 17442114. . wodurch eine Änderung der Proteinfaltung von Cas9 erfolgt und die Ziel-DNA von der crRNA-spacer-Sequenz durch Basenpaarung gebunden wird.F. Jiang, D. W. Taylor, J. S. Chen, J. E. Kornfeld, K. Zhou, A. J. Thompson, E. Nogales, J. A. Doudna: Structures of a CRISPR-Cas9 R-loop complex primed for DNA cleavage. In: Science. Band 351, Nummer 6275, Februar 2016, S. 867–871, doi:10.1126/science.aad8282, PMID 26841432. Bei der CRISPR/Cas-Methode wird die crRNA-spacer-Sequenz geändert, um an eine andere Ziel-DNA zu binden. Die Sequenz des crRNA-spacer bestimmt, welche Ziel-DNA-Sequenz gebunden wird.
Neben Cas9 und der crRNA ist das Vorhandensein eines PAM-Motivs ( ‚Angrenzendes Motiv an den Protospacer‘) mit der Sequenz NGG (mit N als beliebige Nukleinbase gefolgt von zwei Guaninen) in der Ziel-DNA notwendig für eine Aktivierung von Cas9.S. H. Sternberg, S. Redding, M. Jinek, E. C. Greene, J. A. Doudna: DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. In: Nature. Band 507, Nummer 7490, März 2014, S. 62–67, doi:10.1038/nature13011, PMID 24476820, . Der Schnitt der DNA erfolgt drei Nukleotide vor dem PAM. Zudem ist noch eine weitere RNA notwendig, die tracrRNA, von engl. trans-acting CRISPR RNA. Die tracrRNA ist teilweise komplementär zur crRNA, weshalb sie aneinander binden. Die tracrRNA bindet an eine Vorläufer-crRNA, bildet eine RNA-Doppelhelix und wird durch die RNase III in die aktive Form überführt.E. Deltcheva, K. Chylinski, C. M. Sharma, K. Gonzales, Y. Chao, Z. A. Pirzada, M. R. Eckert, J. Vogel, E. Charpentier: CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. In: Nature. Band 471, Nummer 7340, März 2011, S. 602–607, doi:10.1038/nature09886, PMID 21455174, .S. J. Brouns: Molecular biology. A Swiss army knife of immunity. In: Science. Band 337, Nummer 6096, August 2012, S. 808–809, doi:10.1126/science.1227253, PMID 22904002. Die beiden RNA-Stränge der crRNA und der tracrRNA können auch in einem einzelnen, teilweise selbsthybridisierenden RNA-Strang untergebracht werden (sgRNA ‚single guide RNA‘). Durch diese Komponenten wird die DNA gebunden und von der Endonukleasefunktion nahe der Bindungsstelle an beiden Strängen der Ziel-DNA geschnitten. In lebenden Organismen folgt nach einem doppelsträngigen DNA-Schnitt eine DNA-Reparatur. Die Reparatur des erzeugten Doppelstrangbruchs erfolgt durch homology-directed repair (HDR) oder durch non-homologous end joining (NHEJ). Bei der CRISPR/Cas-Methode ist die HDR aufgrund der Genauigkeit die bevorzugte Form der DNA-Reparatur.M. Lu, S. Billerbeck: Improving homology-directed repair by small molecule agents for genetic engineering in unconventional yeast?-Learning from the engineering of mammalian systems. In: Microbial biotechnology. Band 17, Nummer 2, Februar 2024, S. e14398, doi:10.1111/1751-7915.14398, PMID 38376092, .M. Liu, S. Rehman, X. Tang, K. Gu, Q. Fan, D. Chen, W. Ma: Methodologies for Improving HDR Efficiency. In: Frontiers in genetics. Band 9, 2018, S. 691, doi:10.3389/fgene.2018.00691, PMID 30687381, .H. Yang, S. Ren, S. Yu, H. Pan, T. Li, S. Ge, J. Zhang, N. Xia: Methods Favoring Homology-Directed Repair Choice in Response to CRISPR/Cas9 Induced-Double Strand Breaks. In: International Journal of Molecular Sciences. Band 21, Nummer 18, September 2020, doi:10.3390/ijms21186461, PMID 32899704, .S. A. Smirnikhina, M. I. Zaynitdinova, V. A. Sergeeva, A. V. Lavrov: Improving Homology-Directed Repair in Genome Editing Experiments by Influencing the Cell Cycle. In: International Journal of Molecular Sciences. Band 23, Nummer 11, Mai 2022, doi:10.3390/ijms23115992, PMID 35682671, .W. Sun, H. Liu, W. Yin, J. Qiao, X. Zhao, Y. Liu: Strategies for Enhancing the Homology-Directed Repair Efficiency of CRISPR-Cas Systems. In: The CRISPR journal. Band 5, Nummer 1, Februar 2022, S. 7–18, doi:10.1089/crispr.2021.0039, PMID 35076280.
Eine alternative Methode mit gleicher Spannbreite möglicher DNA-Zielsequenzen ist das CRISPR/Cpf1-System und das CRISPR/Cas12b-System. Alternativ zum CRISPR/Cas-System können teilweise Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALEN) und Zinkfingernukleasen (ZFN) verwendet werden. Jedoch sind diese beiden Methoden mit höherem Aufwand zur Anpassung an unterschiedliche Zielsequenzen verbunden, da zuerst ein Proteindesign zur Änderung der Bindungsspezifität notwendig ist, während die Bindungsspezifität bei Cas-Proteinen je nach Verwendung durch die gebundene crRNA bzw. sgRNA erfolgt und somit leichter zu ändern ist. Alle diese Methoden werden umgangssprachlich als Genschere bezeichnet.
Komponenten Komponente Funktion crRNA Enthält die Guide RNA, die das richtige Segment der Wirts-DNA lokalisiert, zusammen mit einer Region, die an die tracrRNA bindet (im Allgemeinen in Form einer Haarnadelschleife) und einen aktiven Komplex bildet. tracrRNA Bindet an crRNA und bildet einen aktiven Komplex. sgRNA Single-guide RNAs sind kombinierte RNAs, die aus einer tracrRNA und mindestens einer crRNA bestehen. Cas9 (oder Alternative) Ein Enzym, dessen aktive Form die DNA verändern kann. Es gibt viele Varianten mit unterschiedlichen Funktionen (z. B. Einzelstrangeinkerbung, Doppelstrangbruch, DNA-Bindung) aufgrund der Funktion jedes Enzyms zur Erkennung von DNA-Stellen. Reparaturvorlage DNA-Molekül, das im DNA-Reparaturprozess der Wirtszelle als Vorlage dient und das Einfügen einer spezifischen DNA-Sequenz in das von Cas9 geteilte Wirtssegment ermöglicht.
Alternativen zu Cas9 Protein Hauptanwendung / Charakteristiken Jahr/eCas12 Cas12a ist kleiner und einfacher als Cas9; Cas12b u. a. für das Genome Engineering bei Pflanzen.Cas13für RNA-EditingCas32019CasMINI Etwa doppelt so kompakt wie die gebräuchlicheren Cas9 und Cas12a. 2021
Unterschiede zwischen Cas9, Cpf1 und Cas12b