Die Molekülmarkierung ( labeling, labelling, tagging) ist eine Methode der Chemie und Biochemie zur selektiven Bindung eines Atoms oder Moleküls an ein Molekül. Die Markierung wird zur weiteren Verfolgung des markierten Moleküls oder zur Aufklärung eines Reaktionsmechanismus ( crossover experiment) verwendet.
Eigenschaften mini|GFP aus Aequorea victoria, eine typische Fluoreszenzmarkierung Moleküle können je nach ihren charakteristischen funktionellen Gruppen mit einer selektiv bindenden Markierung versehen werden, die ein nachverfolgbares Signalmolekül (Reportermolekül) trägt. Die Markierung besteht aus einer bindenden Gruppe (Kopplungsgruppe), gelegentlich einem Verbinder (Linker) und einem nachweisbaren Molekül (Reporter). Die Markierung ist dabei über die Kopplungsgruppe meistens kovalent verbunden. Bei Nukliden kann sie aber auch ionisch und bei indirekten Nachweisen über eine Mischung aus ionischen Bindungen, Van-der-Waals-Bindungen, hydrophoben Effekten, Wasserstoffbrücken und teilweise auch Disulfidbrücken gebunden sein. Im Gegensatz zu einer Färbung mit den meisten selektiv bindenden Proteinfarbstoffen oder Nukleinsäurefarbstoffen erfolgt die kovalente Markierung von Biomolekülen entweder an einzelnen Atomen oder sequenzspezifisch.
Reportertypen Die Reportermoleküle werden meist über selektiv reaktive Kopplungsgruppen kovalent mit einem flexiblen Abstandshalter ( linker ‚Verbinder‘) an bestimmte funktionelle Gruppen des zu markierenden Moleküls gekoppelt. Einen Sonderfall bilden die Nuklide, die aufgrund ihrer vergleichsweise geringen Molekülgröße auch direkt an ein anderes Molekül gekoppelt werden können (ohne reaktive Kopplungsgruppe oder linker). Während zur Markierung von kleinen Molekülen meistens eine Isotopenmarkierung verwendet wird, wurden für die Markierung der verschiedenen Biopolymere wie Proteine und DNA viele unterschiedliche Reportertypen entwickelt.
Als Reportermoleküle bei Markierungen werden Nuklide (radioaktive und nicht radioaktive), Biotin, Reporterenzyme, Oligonukleotide, Fluorophore (im Zuge einer Fluoreszenzmarkierung) oder bei Proteinen auch Protein-Tags eingesetzt.M. J. Hinner, K. Johnsson: How to obtain labeled proteins and what to do with them. In: Current Opinion in Biotechnology. Band 21, Nummer 6, Dezember 2010, S. 766–776, doi:10.1016/j.copbio.2010.09.011. PMID 21030243.R. Wombacher, V. W. Cornish: Chemical tags: applications in live cell fluorescence imaging. In: Journal of biophotonics. Band 4, Nummer 6, Juni 2011, S. 391–402, doi:10.1002/jbio.201100018. PMID 21567974.H. M. O’Hare, K. Johnsson, A. Gautier: Chemical probes shed light on protein function. In: Current opinion in structural biology. Band 17, Nummer 4, August 2007, S. 488–494, doi:10.1016/j.sbi.2007.07.005. PMID 17851069.L. W. Miller, V. W. Cornish: Selective chemical labeling of proteins in living cells. In: Current opinion in chemical biology. Band 9, Nummer 1, Februar 2005, S. 56–61, doi:10.1016/j.cbpa.2004.12.007. PMID 15701454.
Kopplungsarten Die Markierungen mit Nukliden besitzen unter den Markierungen die kleinsten Änderungen der Molmasse und führen daher zu einer vergleichsweise geringeren Änderung der Proteinstruktur und der biologischen Aktivität, die radioaktiven Nuklide sind jedoch von erhöhten Sicherheitsmaßnahmen und Anforderungen an das Sicherheitslabor begleitet. Nuklide (Isotope und Isobare) können direkt kovalent an das zu markierende Molekül gekoppelt werden (chemische Kopplung), daneben auch kovalent über eine Kopplungsgruppe angefügt werden, ionisch gekoppelt werden (z. B. über Chelatoren wie DTPA, TTHA oder chelierende Peptide wie das Protein-Tag His-Tag)D. R. Reddy, L. E. Pedró Rosa, L. W. Miller: Luminescent trimethoprim-polyaminocarboxylate lanthanide complex conjugates for selective protein labeling and time-resolved bioassays. In: Bioconjugate Chemistry. Band 22, Nummer 7, Juli 2011, S. 1402–1409, doi:10.1021/bc200131k. PMID 21619068. .N. Maindron, S. Poupart, M. Hamon, J. B. Langlois, N. Plé, L. Jean, A. Romieu, P. Y. Renard: Synthesis and luminescence properties of new red-shifted absorption lanthanide(III) chelates suitable for peptide and protein labelling. In: Organic & biomolecular chemistry. Band 9, Nummer 7, April 2011, S. 2357–2370, doi:10.1039/c0ob00832j. PMID 21321764.G. Licini, P. Scrimin: Metal-ion-binding peptides: from catalysis to protein tagging. In: Angewandte Chemie. Band 42, Nummer 38, Oktober 2003, S. 4572–4575, doi:10.1002/anie.200301668. PMID 14533147. durch eine chemische Totalsynthese (z. B. per Peptidsynthese, per Phosphoramidit-Synthese) oder in einer Biosynthese durch den Umbau Nuklid-markierter Vorläufersubstanzen erzeugt werden (metabolische Markierung). Im Zuge einer chemischen Isotopenmarkierung oder einer metabolischen Isotopenmarkierung werden Moleküle mit radioaktiven Isotopen (z. B. 3H,G. H. Müller: Protein labelling with 3H-NSP (N-succinimidyl-[2,3-3H]propionate). In: Journal of cell science. Band 43, Juni 1980, S. 319–328, PMID 7419623. 11C,B. Långström, F. Karimi, Y. Watanabe: Endogenous compounds labeled with radionuclides of short half-life-some perspectives. In: Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals. Band 56, Nummer 3–4, 2013 Mar-Apr, S. 251–262, doi:10.1002/jlcr.3033. PMID 24285332. 13C,G. van Hall: Correction factors for 13C-labelled substrate oxidation at whole-body and muscle level. In: The Proceedings of the Nutrition Society. Band 58, Nummer 4, November 1999, S. 979–986, PMID 10817166. 14C,M. Palmblad, B. A. Buchholz, D. J. Hillegonds, J. S. Vogel: Neuroscience and accelerator mass spectrometry. In: Journal of Mass Spectrometry. Band 40, Nummer 2, Februar 2005, S. 154–159, doi:10.1002/jms.734. PMID 15706618. 13N,P. W. Miller, N. J. Long, R. Vilar, A. D. Gee: Synthesis of 11C, 18F, 15O, and 13N radiolabels for positron emission tomography. In: Angewandte Chemie. Band 47, Nummer 47, 2008, S. 8998–9033, doi:10.1002/anie.200800222. PMID 18988199. 15O, 18F, 26Al, 32P,A. M. Tolkovsky, A. Wyttenbach: Differential phosphoprotein labelling (DIPPL) using 32P and 33P. In: Methods in molecular biology. Band 527, 2009, S. 21–9, xi, . PMID 19241002. 33P, 35S,M. A. Lydan, D. H. O’Day: Production of 35S-labeled proteins in E. coli and their use as molecular probes. In: Methods in molecular biology. Band 31, 1994, S. 389–396, doi:10.1385/0-89603-258-2:389. PMID 7921035. 36Cl, 41Ca, 125I,F. W. FITCH, J. WINEBRIGHT, P. V. HARPER: Iodine-125 as a protein label in immunology. In: Science. Band 135, Nummer 3508, März 1962, S. 1068–1069, PMID 13893326. 131IL. R. MELCHER, S. P. MASOUREDIS: The in vivo stability of the I131 protein label of rabbit antibody in guinea pigs as determined by the quantitative precipitin reaction. In: Journal of Immunology. Band 67, Nummer 5, November 1951, S. 393–402, PMID 14898075.) markiert. Die Isotope von nicht natürlicherweise in Biomolekülen vorkommenden Elementen wie Iod, 99Technetium oder 113Indium müssen bei einer metabolischen Markierung zuvor chemisch an die Vorläufermoleküle gekoppelt werden.C. Xavier, N. Devoogdt, S. Hernot, I. Vaneycken, M. D’Huyvetter, J. De Vos, S. Massa, T. Lahoutte, V. Caveliers: Site-specific labeling of his-tagged Nanobodies with 99mTc: a practical guide. In: Methods in molecular biology. Band 911, 2012, S. 485–490, . PMID 22886271.M. H. Adatepe, P. Penkoske, A. Van Amberg, T. Wharton, R. G. Evens, E. J. Potchen: Red cell and plasma protein labeling with 113 m In. In: The International journal of applied radiation and isotopes. Band 22, Nummer 8, August 1971, S. 498–501, PMID 5097086.
Die anderen Arten der Reportermoleküle können kovalent über eine Kopplungsgruppe angefügt werden, durch eine chemische Totalsynthese oder in einer Biosynthese erzeugt werden. Die Biosynthese erfolgt im Stoffwechsel durch den Umbau Reporter-markierter Vorläufersubstanzen (metabolische Markierung). Eine Markierung kann bei hoher Selektivität und geringer Toxizität auch teilweise metabolisch und teilweise synthetisch erfolgen, wie bei der bioorthogonalen Markierung.J. A. Prescher, D. H. Dube, Carolyn Bertozzi: Chemical remodelling of cell surfaces in living animals. In: Nature. Band 430, Nummer 7002, August 2004, S. 873–877, doi:10.1038/nature02791. PMID 15318217.J. A. Prescher, C. R. Bertozzi: Chemistry in living systems. In: Nature Chemical Biology. Band 1, Nummer 1, Juni 2005, S. 13–21, doi:10.1038/nchembio0605-13. PMID 16407987.A. B. Neef, N. W. Luedtke: Dynamic metabolic labeling of DNA in vivo with arabinosyl nucleosides. In: Proceedings of the National Academy of Sciences. Band 108, Nummer 51, Dezember 2011, S. 20404–20409, doi:10.1073/pnas.1101126108. PMID 22143759. . Dabei werden metabolisch eingebaute Vorläufersubstanzen nach einer Proteinreinigung bzw. DNA-Reinigung anschließend zur nachträglichen chemischen Kupplung eines Reportermoleküls anhand der selektiv reaktiven Gruppe verwendet, z. B. per Click-ChemieH. C. Kolb, M. G. Finn, K. B. Sharpless: Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions. In: Angewandte Chemie. Band 40, Nummer 11, Juni 2001, S. 2004–2021, PMID 11433435.A. Cieslar-Pobuda, M. J. Los: Prospects and limitations of „Click-Chemistry“-based DNA labeling technique employing 5-ethynyl-2'deoxyuridine (EdU). In: Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. Band 83, Nummer 11, November 2013, S. 977–978, doi:10.1002/cyto.a.22394. PMID 24115755. (1,3-dipolare Cycloaddition mit Aziden und Cyclooctynen, eine Kupfer-freie Click-Chemie),J. M. Baskin, J. A. Prescher, S. T. Laughlin, N. J. Agard, P. V. Chang, I. A. Miller, A. Lo, J. A. Codelli, C. R. Bertozzi: Copper-free click chemistry for dynamic in vivo imaging. In: Proceedings of the National Academy of Sciences. Band 104, Nummer 43, Oktober 2007, S. 16793–16797, doi:10.1073/pnas.0707090104. PMID 17942682, . per Cycloaddition zwischen Nitronen und Cyclooctynen,Xinghai Ning, Rinske P. Temming u. a.: Protein Modification by Strain-Promoted Alkyne-Nitrone Cycloaddition. In: Angewandte Chemie International Edition. 49, 2010, S. 3065–3068, doi:10.1002/anie.201000408. per Oxim/Hydrazon-Bildung aus Aldehyden oder Ketonen, per Tetrazin-Ligation, per Isonitril-basierter Click-Reaktion, per Quadricyclan-Ligation und per Staudinger-Reaktion zwischen Aziden und Triarylphosphinen.E. Saxon, C. R. Bertozzi: Cell surface engineering by a modified Staudinger reaction. In: Science. Band 287, Nummer 5460, März 2000, S. 2007–2010, PMID 10720325.N. J. Agard, J. M. Baskin, J. A. Prescher, A. Lo, C. R. Bertozzi: A comparative study of bioorthogonal reactions with azides. In: ACS chemical biology. Band 1, Nummer 10, November 2006, S. 644–648, PMID 17175580.S. H. Weisbrod, A. Baccaro, A. Marx: Site-specific DNA labeling by Staudinger ligation. In: Methods in molecular biology. Band 751, 2011, S. 195–207, . PMID 21674332.