Bei der sogenannten Bunten Reihe handelt es sich um eine labortechnische Methode zur Bestimmung (Identifizierung) von Bakterien und Hefen anhand verschiedener Merkmale. Dabei wird auf bestimmte Enzymaktivitäten, den Abbau von Substraten, die Bildung von Stoffwechselprodukten und andere Fähigkeiten (beispielsweise aktive Bewegung) geprüft. Die Bunte Reihe besteht aus Reagenzröhrchen, gegebenenfalls auch Petrischalen, die mit verschiedenen Nährmedien beschickt sind. Die Nährmedien enthalten Reagenzien und Indikatoren zum Nachweis von bestimmten Eigenschaften, die eine Bestimmung von Bakterien auf Ebene der Gattung oder sogar der Art ermöglichen. Beimpft werden die Röhrchen mit einer Reinkultur des zu bestimmenden Bakteriums. Die Ergebnisse (positiv oder negativ) werden mit einer Tabelle verglichen und so kann man mit einer bestimmten Wahrscheinlichkeit die unbekannte Reinkultur einer Spezies zuordnen.
Kleine Bunte Reihe Die älteste und kompakteste Version ist die traditionelle kleine Bunte Reihe, die vor allem zur Bestimmung von Enterobakterien dient. Sie enthält: Kligler-Agar, Harnstoff-Agar, MIO-Röhrchen und Simmons Citrat-Agar. Die Nährmedien werden je nach Art des Mediums verschieden beimpft. In den meisten Fällen sind damit die häufigsten Enterobakterien schnell zu bestimmen, jedoch gibt es Ausnahmen und Unregelmäßigkeiten. Genauer ist die Untersuchung mittels eines Systems, bei dem 20 bis 30 biochemische Untersuchungen innerhalb von 24 Stunden durchgeführt und visuell oder elektronisch ausgewertet werden können (zum Beispiel Analytical Profile Index API-20E).
Zur Reinheitskontrolle wird auf Columbia-Blutagar ausgestrichen um eine Kontamination z. B. durch grampositive Erreger auszuschließen. Die Kolonien müssen wie die zur Beimpfung der Bunten Reihe verwendete aussehen und es dürfen keine anderen Kolonien auf dem Agar wachsen.
Kligler-Agar Hierbei handelt es sich um ein Nährmedium zur Identifizierung gramnegativer Darmbakterien nach (1917, 1918), beispielsweise Salmonella, Shigella, Escherichia, Enterobacter und Proteus. Es dient dem Nachweis des Lactose-Abbaus durch das Enzym β-Galactosidase, der Verwertbarkeit der vorhandenen Kohlenhydrate in einer Gärung, erkennbar an der Säurebildung beim Abbau und ggf. an Gasbildung (CO2), sowie der Bildung von Schwefelwasserstoff (H2S). Statt des klassischen Kligler-Agars mit zwei enthaltenen Zuckern wird häufig auch der TSI-Agar (triple sugar iron agar, Dreizucker-Eisen-Agar) verwendet, der vergleichbare Ergebnisse liefert. Die H2S-Bildung kann auch mit Hilfe des SIM-Agars (Schwefelwasserstoff-Bildung, Indol-Bildung, Motilität) nachgewiesen werden. Die Schwefelwasserstoff-Bildung ist typisch für einige Arten in den Gattungen Citrobacter, Proteus (bzw. Cosenzaea) und Salmonella.
Wirkungsweise mini|Verschiedene Ergebnisse des TSI-Agars (von links nach rechts): (a) Bakterium kann verschiedene Kohlenhydrate verwerten, einschließlich Lactose und hat Gas produziert, (b) Bakterium kann nur Glucose verwerten, (c) Bakterium hat H2S produziert, (d) keine Reaktion oder Nährmedium nicht beimpft. Das Nährmedium wird als Schrägagarröhrchen verwendet, bei der Inokulation wird zunächst parallel zum Röhrchen in den Agar gestochen und danach auf der Schrägfläche in einer mäanderförmigen Linie ausgestrichen. Durch den Glucoseabbau entsteht Säure und bei pH < 7 wird der pH-Indikator Phenolrot gelb. Durch die Entstehung alkalischer Stoffwechselprodukte aus dem Peptonabbau sowie durch Oxidation der Säuren an der Schrägfläche in Gegenwart von Luftsauerstoff wird der Nährboden im oberen Bereich re-alkalisiert (der pH-Wert steigt über 7) und dieser Teil des Mediums wird rot. Falls neben Glucose auch Lactose abgebaut wird (β-Galactosidase-Aktivität positiv), entsteht dadurch zusätzliche Säure, dann bleibt der gesamte Nährboden durch die größere Säuremenge gelb. Geschieht dies ohne Verwendung von Sauerstoff in einer Gärung, so bildet sich CO2, das als kleine bis große Gasblasen und Risse im Nährboden sichtbar wird. Aus der schwefelhaltigen anorganischen Verbindung Natriumthiosulfat gebildetes H2S reagiert mit dem enthaltenen Eisensalz zu Eisensulfid, das als schwarzer Niederschlag ausfällt.
Typische Zusammensetzung Der Nährboden besteht meistens aus (Angaben in Gramm pro Liter): Pepton aus Casein 15,0 Pepton aus Fleisch 5,0 Fleischextrakt 3,0 Hefeextrakt 3,0 Natriumchlorid 5,0 Lactose (Substrat) 10,0 Saccharose (Substrat) 10,0 D-Glucose (Substrat) 1,0 Ammoniumeisen(III)-citrat (Reagenz) 0,5 Natriumthiosulfat (Substrat) 0,5 Phenolrot (pH-Indikator) 0,024 Agar-Agar 12,0
Harnstoff-Agar Mit Hilfe des Harnstoff-Agars nach (1946) gelingt die Unterscheidung von Bakterien, die über das Enzym Urease verfügen, von denen, die Urease-negativ sind. Urease ist ein Enzym, das Harnstoff hydrolysieren kann. Vertreter der Gattungen Klebsiella, Proteus und Yersinia verfügen über die Urease, während beispielsweise Escherichia, Providencia, Salmonella, Serratia und Shigella Urease-negativ sind. Bei den Gattungen Citrobacter und Enterobacter gibt es sowohl Urease-positive wie -negative Arten.
Wirkungsweise mini|Serratia odorifera auf Harnstoff Agar nach Christensen, mit negativem Ergebnis (der Mikroorganismus verfügt nicht über das Enzym Urease, das Harnstoff zu Ammoniak hydrolysiert).
Der Harnstoff-Agar kann in Reagenzröhrchen als Schrägagarröhrchen oder in Petrischalen verwendet werden, dabei wird eine relativ große Menge der Reinkultur ausgestrichen. Das fertige Nährmedium enthält Harnstoff, wird dieser durch ein Bakterium, das das Enzym Urease besitzt, verwertet, so entsteht Kohlenstoffdioxid und Ammoniak. Durch den Ammoniak wird das Medium alkalisch (pH > 7) und der enthaltene pH-Indikator Phenolrot zeigt dies durch Farbumschlag von Gelb nach Rotviolett an. Verfügt das Bakterium nicht über das Enzym Urease, erfolgt keine Harnstoffspaltung und das Medium bleibt gelblich, bedingt durch den enthaltenen pH-Indikator. Auch Urease-negative Bakterien können auf dem Medium wachsen, da es Glucose als Energie- und Kohlenstoffquelle enthält, aber ihr Wachstum führt nicht zu einer Farbveränderung des Mediums.
Typische Zusammensetzung Der Nährboden besteht meistens aus (Angaben in Gramm pro Liter): Pepton aus Fleisch 1,0 D-Glucose 1,0 Natriumchlorid 5,0 Kaliumdihydrogenphosphat 2,0 Harnstoff (Substrat) 20,0 Phenolrot (pH-Indikator) 0,012 Agar-Agar 12,0
MIO-Röhrchen mini|Positiver Indol-Test, erkennbar an der rot-violetten Verfärbung des Reagenz. Mit Hilfe des MIO-Agars lassen sich Bakterien aus der Ordnung der Enterobacterales (Enterobakterien) weiter voneinander unterscheiden. Die Abkürzung MIO resultiert aus drei Merkmalen, die man mit diesem Medium nachweisen kann: (1) aktive Beweglichkeit (Motilität, im Englischen motility). Aktive Bewegung wird bei Vertretern der Enterobacterales durch Flagellen verursacht. (2) Bildung von Indol aus Tryptophan durch das Enzym Tryptophanase. (3) Bildung von Putrescin aus Ornithin durch das Enzym Ornithindecarboxylase (ODC). Beispielsweise ist Escherichia positiv für Motilität und Indobildung, aber negativ für ODC, Enterobacter hingegen ist positiv für Motilität und ODC, aber negativ für Indolbildung.
Wirkungsweise Der MIO-Agar wird in Reagenzröhrchen als Hochschichtröhrchen verwendet und durch Einstich mittels einer Impfnadel mit der Reinkultur beimpft. Das fertige Nährmedium ist ein so genannter Weichagar, der Agar-Agar in geringerer Konzentration als üblich enthält, nämlich nur 1 – 4 g/L. In einem Agargel mit so geringer Agar-Konzentration können sich begeißelte Bakterien aktiv schwimmend ausbreiten. Dies führt zu einer Trübung des Mediums durch die Bakterien auch außerhalb des Stichkanals, während bei Bakterien ohne aktive Bewegung nur Wachstum und damit Trübung im Impfkanal zu beobachten ist.
Weiterhin ist im Medium die Aminosäure L-Tryptophan als Substrat enthalten, manche Bakterienarten verfügen über das Enzym Tryptophanase und können somit Tryptophan zu Indol, Pyruvat und Ammoniak abbauen. Das dabei gebildete Indol wird im Indol-Test mit Kovacs-Reagenz nachgewiesen. Dieser Test erfolgt jedoch erst nach der Inkubation und Auswertung der anderen Merkmale, indem man das Reagenz hinzugibt. Eine kirschrote Färbung der Lösung zeigt Indolbildung an (Indol-positive Bakterien), bleibt die Lösung dagegen farblos oder verfärbt sich gelblich, ist das Bakterium Indol-negativ.
Das Medium enthält außerdem noch die Aminosäure L-Ornithin als Substrat und den pH-Indikator Bromkresolpurpur. Wird Ornithin durch ein Bakterium, das das Enzym Ornithindecarboxylase (ODC) besitzt, verwertet, so entsteht durch Decarboxylierung Putrescin (Butan-1,4-diamin). Durch dieses Produkt wird das Medium alkalisch (pH > 7) und der enthaltene pH-Indikator Bromkresolpurpur zeigt dies durch Farbumschlag von Gelb nach Purpur bis Violett an, der ODC-Test ist positiv. Verfügt das Bakterium nicht über das Enzym Ornithindecarboxylase, wird Ornithin nicht abgebaut und das Medium erscheint gelb, bedingt durch den enthaltenen pH-Indikator und die aus Glucose gebildeten Säuren.
Simmons Citrat-Agar Mit Hilfe des Citrat-Agars nach (1926) können Bakterien identifiziert werden, die mit Citrat als einziger Energiequelle wachsen können, indem sie durch dessen Abbau Energie gewinnen. Dies trifft auf einige Vertreter der Enterobacteriaceae zu sowie auf einige Pilze. In der Familie Enterobacteriaceae verhalten sich die meisten Vertreter der Gattungen Citrobacter, Enterobacter und Klebsiella Citrat-positiv, gleiches gilt für Serratia (Familie Yersiniaceae), während Escherichia und Shigella Citrat-negativ sind. Arten bzw. Serotypen von Salmonella verhalten sich unterschiedlich.
Wirkungsweise mini|Cosenzaea myxofaciens (Synonym: Proteus myxofaciens) auf Simmons Citrat-Agar, mit negativem Ergebnis (der Mikroorganismus kann kein Citrat verwerten).
Der Citrat-Agar kann in Reagenzröhrchen als Schrägagarröhrchen oder in Petrischalen verwendet werden und wird mit einer Reinkultur beimpft. Das fertige Nährmedium enthält Natriumcitrat als einzige Energiequelle, den pH-Indikator Bromthymolblau und als Stickstoffquelle lediglich die anorganische Verbindung Ammoniumdihydrogenphosphat. Wenn ein Mikroorganismus Citrat verwerten kann (er verfügt dann über das Enzym Citrat-Lyase), wird dabei Citrat zu Acetyl-CoA und Oxalacetat umgewandelt. Oxalacetat wird weiter zu Pyruvat und Kohlenstoffdioxid (CO2) abgebaut. Aus dem CO2 entsteht mit Wasser auch Hydrogencarbonat (HCO3−) und weiterhin wird Ammoniak (NH3) aus der anorganischen Stickstoffquelle freigesetzt. Diese Reaktionen führen zu einer Alkalisierung (pH > 7) und der im Nährmedium enthaltene pH-Indikator Bromthymolblau zeigt dies durch Farbumschlag von grün nach blau an. Kann das Bakterium kein Citrat verwerten, erfolgt keine pH-Erhöhung und das Medium bleibt grün, bedingt durch den enthaltenen pH-Indikator. In diesem Fall erfolgt aber auch kein Wachstum, da außer Citrat keine anderen Energiequellen enthalten sind.
Typische Zusammensetzung Der Nährboden besteht meistens aus (Angaben in Gramm pro Liter): Ammoniumdihydrogenphosphat 1,0 Dikaliumhydrogenphosphat 1,0 Natriumchlorid 5,0 Magnesiumsulfat 0,2 Natriumcitrat (Substrat) 2,0 Bromthymolblau (pH-Indikator) 0,012 Agar-Agar 13,0
Erweiterte Bunte Reihe Da man mit der kleinen Bunten Reihe nicht immer eine ausreichende Identifizierung der unbekannten Reinkultur erhält, können nach dem gleichen Prinzip weitere Tests durchgeführt werden. Zur Unterscheidung der Enterobakterien werden insbesondere die IMViC-Reaktionen durchgeführt, dabei handelt es sich um den bereits erwähnten Indol-Test, die Methylrot-Probe auf Säurebildung, den Voges-Proskauer-Test auf Acetoin-Bildung und den ebenfalls schon beschriebenen Nachweis der Citrat-Verwertung.