mini|Agarosegel mit PCR-Produkten. Wenn die PCR spezifisch erfolgt ist, ergibt sich in einer einfachen PCR nur eine Bande pro Spur, bei einer Multiplex-PCR mehrere. Die erste und die letzte Spur enthalten eine DNA-Leiter. Die PCR-Optimierung umfasst die gezielte Veränderung der Reaktionsbedingungen einer Polymerasekettenreaktion.
Optimierungsparameter Eine Optimierung PCR-verwandter Methoden umfasst die gezielte Veränderung verschiedener Parameter. Wahl einer geeigneten thermostabilen DNA-Polymerase Entwurf der Sequenz des Primers (Primerdesign) Veränderung der Konzentrationen von Substraten (DNA-Vorlage, Primer-Vorlage, dNTP-Konzentration) Veränderung der Konzentrationen von Produkten (mehr kopierte DNA, korrektes Produkt, weniger Pyrophosphat), Vermeidung von Störsubstanzen (z. T. Substrat-ähnliche Inhibitoren) Steuerung der Umgebungsbedingungen (Temperatur, Thermostabilität, Ionenstärke, Osmolarität, Cofaktoren).
Polymerase
Die Wahl einer geeigneten DNA-Polymerase hat einen Einfluss auf die Synthesemenge und Fehlerrate.
Primer
Das Primerdesign umfasst die Auswahl geeigneter DNA-Sequenzen für die Primer und der darauf basierenden Primerhybridisierungs-Temperatur (synonym Annealing-Temperatur) in der PCR. Die Annealing-Temperatur der PCR liegt meistens zwei Grad Celsius unter der Schmelztemperatur der Primer, was einen Kompromiss zwischen einer möglichst vollständigen Primerhybridisierung und einer möglichst hohen Spezifität der Primerbindung darstellt.
Substratkonzentration Die Endkonzentration der Primer während der PCR liegt zwischen 0,1 μM und 1μM (meistens 0,4 μM), die Konzentration an dNTPs beträgt für jede der vier Nukleinbasen etwa 100 – 1000 μM (meistens je 400 μM) und die Massenkonzentration der DNA von 1 bis 20 ng pro Mikroliter des PCR-Ansatzes (meistens 200 ng pro Ansatz).
Temperaturzyklus mini|Temperaturzyklus der PCR mit Dissoziation (1), Hybridisierung (2) und Synthese (3). Die Dissoziation (das Schmelzen) der doppelsträngigen DNA wird meistens bei 95 °C durchgeführt. Daraufhin erfolgt die Hybridisierung (das Annealing) bei einer Primer-abhängigen Temperatur, zuletzt erfolgt die Synthese der DNA am jeweiligen Optimum der jeweiligen thermostabilen DNA-Polymerase bei 74 °C (Typ-A- und Typ-B-Polymerasen).
Fehlerrate mini|Ablauf der DNA-Synthese mit Typ-B-Polymerasen. Die Fehlerraten verschiedener Polymerasen (engl. ) sind bekannt und beschrieben worden. Bakterielle thermostabile DNA-Polymerasen (Typ A) besitzen meist eine höhere Fehlerrate als Archaeische (Typ B), was an der proof reading-Exonukleaseaktivität der B-Typ-Polymerasen liegt. Die Fehlerrate der Taq-Polymerase beträgt 8 · 10−6 Fehler pro Basenpaar, die der KOD-Polymerase 3,5 · 10−6 Fehler pro Basenpaar, die der Tli-Polymerase und der Herculase 2,8 · 10−6 Fehler pro Basenpaar, die der Pfu-Polymerase 1,3 · 10−6 Fehler pro Basenpaar und die der Pfu Ultra 4,3 · 10−7 Fehler pro Basenpaar.J. Cline, J. C. Braman, H. H. Hogrefe: PCR fidelity of pfu DNA polymerase and other thermostable DNA polymerases. In: Nucleic Acids Research. (1996), Bd. 24(18), S. 3546-51. PMID 8836181; .
Syntheserate Die Gesamt-Synthesegeschwindigkeit einer DNA-Polymerase hängt unter anderem von der Basissyntheserate und der Prozessivität der Polymerase sowie der Anwesenheit von Hemmstoffen (z. B. hemmende Produkte, PCR-Inhibitoren) ab.
Die Basissyntheseraten verschiedener Polymerasen (engl. ) sind verglichen worden. PDF. Die Syntheserate der Taq-Polymerase liegt bei etwa 60 Basenpaaren pro Sekunde. Unter den unmodifizierten thermostabilen DNA-Polymerasen liegt nur die Syntheserate der KOD-Polymerase über 100 Basenpaaren pro Sekunde (circa 120 bp/s). Unter den modifizierten thermostabilen DNA-Polymerasen sind verschiedene Mutationen beschrieben worden, die die Syntheserate steigern. Die KOD-Polymerase und einige modifizierte thermostabile DNA-Polymerasen (iProof, Pfu Ultra, Phusion, Velocity oder Z-Taq) werden aufgrund ihrer hohen Syntheserate zu einer PCR-Variante mit kürzeren Amplifikationszyklen eingesetzt (Fast-PCR, High-speed PCR).
Die Prozessivität (engl. ) beschreibt die durchschnittliche Anzahl an Basenpaaren, bevor eine Polymerase von der DNA-Vorlage (engl. ) abfällt. Die Prozessivität der verwendeten Polymerase begrenzt den maximalen Abstand des Primers zur Sonde in der real time quantitative PCR. Die Prozessivität einer Taq-Polymerase liegt bei etwa 200 Basenpaaren.
Beim Erhitzen der dNTPs in wässrigen Lösungen desaminieren die Cytosin-Reste im dCTP kontinuierlich zu Uracil-Resten, welche die Syntheserate der DNA-Polymerasen herabsetzen. Um dieser als dUTP-Vergiftung bezeichneten Herabsetzung entgegenzuwirken, wird bei Produkten von über 5 Kilobasen gelegentlich bei einer PCR mit archaeischen Polymerasen eine thermostabile dUTPase hinzugesetzt.Y. Cho, H. S. Lee, Y. J. Kim, S. G. Kang, S. J. Kim, J. H. Lee: Characterization of a dUTPase from the hyperthermophilic archaeon Thermococcus onnurineus NA1 and its application in polymerase chain reaction amplification. In: Mar Biotechnol (NY) (2007), Bd. 9(4), S. 450-8. PMID 17549447. Analog desaminieren parallel auch die Adenosin-Reste im dATP zu Desoxyinosintriphosphat (dITP), was ebenfalls zu einer Hemmung der archaeischen DNA-Polymerasen führen kann. Daher kann auch eine thermostabile dITPase zur PCR mit archaeischen DNA-Polymerasen hinzugesetzt werden.Y. J. Kim, Y. G. Ryu, H. S. Lee, Y. Cho, S. T. Kwon, J. H. Lee, S. G. Kang: Characterization of a dITPase from the hyperthermophilic archaeon Thermococcus onnurineus NA1 and its application in PCR amplification. In: Appl Microbiol Biotechnol. (2008), Band 79(4), S. 571-8. PMID 18438658.
Da die DNA-Polymerase die DNA-Kettenverlängerung unter Abspaltung von Pyrophosphat katalysiert, kann die Produktkonzentration durch Zugabe einer thermostabilen Pyrophosphatase erhöht werden. Die Pyrophosphatase katalysiert die Hydrolyse des Pyrophosphats zu Phosphaten, wodurch weniger Produkthemmung entsteht, da die Gleichgewichtskonstante der Reaktion zu Gunsten der synthetisierten DNA verändert wird.P. B. Vander Horn, M. C. Davis, J. J. Cunniff, C. Ruan, B. F. McArdle, S. B. Samols, J. Szasz, G. Hu, K. M. Hujer, S. T. Domke, S. R. Brummet, R. B. Moffett, C. W. Fuller: Thermo Sequenase DNA polymerase and T. acidophilum pyrophosphatase: new thermostable enzymes for DNA sequencing. In: Biotechniques (1997), Band 22(4), S. 758-62, 764-5. PMID 9105629. S. Y. Park, B. Lee, K. S. Park, Y. Chong, M. Y. Yoon, S. J. Jeon, D. E. Kim: Facilitation of polymerase chain reaction with thermostable inorganic pyrophosphatase from hyperthermophilic archaeon Pyrococcus horikoshii. In: Appl Microbiol Biotechnol. (2010), Band 85(3), S. 807–12. PMID 19882151.
Das Stoffel-Fragment ist eine um die Exonukleasefunktion gekürzte Taq-Polymerase, wodurch die Produktkonzentration und die Thermostabilität des Enzyms erhöht wird.
Falsch negative Ergebnisse Wird eine PCR durchgeführt und im Ergebnis keine vervielfältigte DNA nachgewiesen, obwohl die nachzuweisende Sequenz tatsächlich vorhanden war, spricht man von einem falsch negativen Ergebnis.
Substratverweigerung Die vor allem bei den archaeischen Polymerasen gelegentlich vorkommende „Verweigerung“ schwieriger Substrate (engl. ) kann zu falsch negativen Ergebnissen führen, z. B. bei aDNA, DNA mit hohem GC-Anteil, genomischer DNA oder DNA mit Sekundärstrukturen. Durch Zugabe schwach chaotroper Moleküle wie Dimethylsulfoxid, Formamid, Trehalose oder Betain kann die Hemmung der Reaktion gemindert werden.G. Sarkar, S. Kapelner, S. S. Sommer: Formamide can dramatically improve the specificity of PCR. In: Nucleic Acids Res. (1990), Band 18(24), S. 7465. PMID 2259646; . Der Einsatz von chaotropen Verbindungen kann die Schmelztemperatur der Primer um bis zu 5 °C absenken, weshalb die -Temperatur der PCR entsprechend angepasst werden muss. Eine Erhöhung der Konzentration an Magnesium-Ionen, als Cofaktor der thermostabilen DNA-Polymerasen, über 1,5 mM hinaus erhöht die Produktkonzentration auf Kosten der Fehlerrate. Manche alkylierte Nukleinbasen können keine Basenpaarung mit den vier natürlichen Nukleinbasen eingehen, weshalb es an diesen Stellen zu einer Unterbrechung der Amplifikation kommt. Durch Zugabe bestimmter modifizierter Nukleinbasen kann eine Basenpaarung bei der PCR erfolgen.Laura A. Wyss, Arman Nilforoushan, Fritz Eichenseher, Ursina Suter, Nina Blatter, Andreas Marx, Shana J. Sturla: Specific Incorporation of an Artificial Nucleotide Opposite a Mutagenic DNA Adduct by a DNA Polymerase. In: Journal of the American Chemical Society. 137, 2015, S. 30–33, doi:10.1021/ja5100542.
Inhibitoren Verschiedene Substanzen können thermostabile DNA-Polymerasen in der PCR stören, z. B. Virostatika, Hämoglobin, Heparin, Polysaccharide, Hormone, IgG, Lactoferrin, Myoglobin, Gallsäuren und ihre Salze, Harnsäure und ihre Salze, Phenol, Polyphenole, Proteasen, divalente Kationen außer Magnesium, EDTA und andere Chelatoren, Huminsäuren, Tonerde, PDF. Kollagen, Hämatine, Indigo, Melanin und Tannine.K. L. Faber, E. C. Person, W. R. Hudlow: PCR inhibitor removal using the NucleoSpin® DNA Clean-Up XS kit. In: Forensic science international. Genetics. Band 7, Nummer 1, Januar 2013, S. 209–213, . doi:10.1016/j.fsigen.2012.06.013. PMID 22784879.Joseph Warren: A Review of PCR Inhibition and It’s Implications for Human Identity Testing. Association of Forensic DNA Analysts and Administrators. (PDF). Im Allgemeinen erfordern Proben mit diesen Stoffen eine weitere DNA-Reinigung vor einer Verwendung in der PCR. Bei Vorhandensein höherer Konzentrationen an Polyphenolen kann Polyvinylpyrrolidon hinzugegeben werden, das diese bindet. Ebenso wird bovines Serumalbumin zur Bindung von Inhibitoren eingesetzt.C. A. Kreader: Relief of amplification inhibition in PCR with bovine serum albumin or T4 gene 32 protein. In: Applied and environmental microbiology. Band 62, Nummer 3, März 1996, S. 1102–1106, PMID 8975603, .
Falsch positive Ergebnisse mini|Die erste Spur ist eine DNA-Leiter, daneben sind alle Banden von PCR-Produkten außer der dunklen schwarzen Bande unerwünscht. Ein falsch positives Ergebnis ist bei einer PCR eine Erzeugung von PCR-Produkten, die nicht der gewünschten und zu vervielfältigenden DNA-Sequenz entsprechen. Sie führt gegebenenfalls zu unerwünschten Banden in einem Agarosegel.
Kontaminationen DNA-Kontaminationen und eine unspezifische Hybridisierung der Primer vor und während der PCR können zu falsch positiven Ergebnissen führen. Insbesondere Kontaminationen sind ein großes Problem. Häufig gelangt DNA von Personen, die an der Analyse beteiligt sind, oder die an der Herstellung von Komponenten mitgewirkt haben, in die Probe. Beim forensischen Einsatz (vgl. DNA-Analyse und Genetischer Fingerabdruck) machte das Heilbronner Phantom Schlagzeilen: Kriminalisten jagten lange Zeit eine vermeintliche Serientäterin, bis sich herausstellte, dass die DNA in Wirklichkeit von der Mitarbeiterin einer Zulieferfirma stammte. Problematisch können bei biologischen Proben auch bakterielle Verunreinigungen, Verunreinigungen durch Parasiten oder Nahrungsbestandteile und ähnliches sein. So wurde der wurmartige Organismus Xenoturbella längere Zeit fälschlich als Vertreter der Weichtiere angesehen, weil man DNA aus dem Darm, welche aus Nahrungsorganismen stammte, irrtümlich für die DNA des Wurms selbst hielt.S. J. Bourlat, C. Nielsen, A. E. Lockyer, D. Timothy, J. Littlewood, M. J. Telford: Xenoturbella is a deuterostome that eats molluscs in Nature. Vol. 424, 2003, S. 925–928, nature.com Besonders bei sehr alter, möglicherweise teilweise fragmentierter DNA, z. B. aus Fossilien, ist besondere Vorsicht geboten. Dies gilt besonders dann, wenn dem Menschen verwandte Sequenzen, z. B. das Erbgut des Neanderthalers, analysiert wird.