Eine DNA-Extraktion beschreibt die Extraktion von DNA aus Zellen. Die DNA-Extraktion ist eine der Methoden zur DNA-Reinigung und vermutlich die am häufigsten verwendete.
Zellaufschluss Die DNA eines Organismus kann auf mehreren Wegen isoliert werden. Die meisten Verfahren beginnen mit einer Konzentration der Zellen durch Zentrifugation und einem für die jeweilige Gruppe geeigneten Zellaufschluss des Zell-Niederschlags. So müssen z. B. bei pflanzlichen, pilzlichen oder bakteriellen Zellen, welche im Vergleich zu tierischen Zellen, Mycoplasmen und einigen Archaeenarten zusätzlich zur Zellmembran eine Zellwand besitzen, meist zusätzliche enzymatische (z. B. Lysozym bei Bakterien oder Proteinase K zur Proteolyse) oder mechanische Zerkleinerungsschritte (Standmixer) erfolgen. Bei der Plasmidpräparation aus Bakterien wird oftmals als chemischer Zellaufschluss die alkalische Lyse verwendet.H. C. Birnboim, J. Doly: A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. In: Nucleic Acids Res. (1979), Band 7(6), S. 1513–23. PMID 388356; .
Nach einem Zellaufschluss folgt meist eine Klärung des Homogenates durch Filtration oder Zentrifugation. DNA aus Mitochondrien oder Chloroplasten können durch eine Zellfraktionierung von der DNA des Zellkerns getrennt werden. Für eine Isolierung extrachromosomaler DNA wie beispielsweise virale DNA wird die Hirt-Extraktion verwendet.B. Hirt: Selective extraction of polyoma DNA from infected mouse cell cultures. In: Journal of molecular biology. Band 26, Nummer 2, Juni 1967, S. 365–369, PMID 4291934. Zur Entfernung der RNA kann ein RNase-Verdau durchgeführt werden.
Extraktionen DNA ist ein polares Biopolymer mit relativ hoher molarer Masse, weshalb sie in unpolarer Umgebung (z. B. in organischen Lösungsmitteln) durch die verkleinerte Hydrathülle und die daraus folgende Absenkung ihrer Löslichkeit ausfällt. Daneben ist DNA in sauren, wässrigen Lösungen unlöslich aufgrund des Desoxyribosephosphat-Rückgrates mit negativen Ladungen proportional zur Kettenlänge, denn bei niedrigen pH-Werten sind die Phosphatgruppen und somit die negativen Ladungen der DNA mit Protonen abgesättigt, wodurch die Hydrathülle sich ebenfalls verkleinert.
Die meisten DNA-Extraktionen basieren nach dem Zellaufschluss auf zwei unterschiedlichen Verfahren, der Zwei-Phasen-Extraktion oder der Fällung, letztere eventuell mit zusätzlicher selektiver Adsorption an eine DNA-bindende Matrix. Die Extraktionsverfahren werden zum Teil auch miteinander kombiniert. Bei den folgenden Methoden folgt meistens eine abschließende Ethanolfällung. Es existieren verschiedene Kits zur DNA-Extraktion, mit unterschiedlichen Ausbeuten.H. Yoshikawa, F. Dogruman-Al, F. Dogruman-Ai, S. Turk, S. Kustimur, N. Balaban, N. Sultan: Evaluation of DNA extraction kits for molecular diagnosis of human Blastocystis subtypes from fecal samples. In: Parasitology research. Band 109, Nummer 4, Oktober 2011, S. 1045–1050, , PMID 21499752. Daneben gibt es verschiedene Varianten der Methoden je nach Ursprung der DNA, beispielsweise für pflanzliche,J. J. Doyle, J. L. Doyle: A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. In: Phytochem. Bull. (1987), Band 19, S. 11–15.David V. Jobes, David L. Hurley, Leonard B. Thien: Plant DNA isolation: a method to efficiently remove polyphenolics, polysaccharides, and RNA. In: TAXON. 44, 2019, S. 379, .T. Dey, S. Saha, T. N. Dhar, S. Adhikary, P. Ghosh: Optimization and comparison of efficiency between two DNA isolation protocols in Cymbopogon species. In: General and Applied Plant Physiology (2010). Band 36, S. 232–238. (PDF).S. Adhikari, S. K. Chattopadhyay, P. D. Ghosh: A simplified high yielding miniprep genomic DNA extraction protocol for three chemotypically different plant species. In: Indian Journal of Biotechnology (2012), Band 11, S. 337–340, (PDF). pilzlicheP. Piper: Isolation of yeast DNA. In: Methods in molecular biology. Band 53, 1996, S. 103–107, , PMID 8924971.L. Fauchery, S. Uroz, M. Buée, A. Kohler: Purification of Fungal High Molecular Weight Genomic DNA from Environmental Samples. In: Methods in molecular biology. Band 1775, 2018, S. 21–35, , PMID 29876806. oder bakterielle DNA.J. Marmur: A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from micro-organisms. In: Journal of Molecular Biology. 3, 1961, S. 208, .J. Marmur: This week's citation classic. In: Current Contents (1991), Band 34, Heft 36. S. 11–12. (PDF).K. L. Greathouse, R. Sinha, E. Vogtmann: DNA extraction for human microbiome studies: the issue of standardization. In: Genome biology. Band 20, Nummer 1, 10 2019, S. 212, , PMID 31639026, .Francisco Salvà Serra, Francisco Salvà-Serra, Liselott Svensson-Stadler, Antonio Busquets, Daniel Jaén-Luchoro, Roger Karlsson, Edward R. B. Moore, Margarita Gomila: A protocol for extraction and purification of high-quality and quantity bacterial DNA applicable for genome sequencing: a modified version of the Marmur procedure.. In: Protocol Exchange. 2018, .
Zwei-Phasen-Extraktion mini|RNA-Extraktion durch Zwei-Phasen-Extraktion und Ethanolfällung. Die Zwei-Phasen-Extraktion basiert auf der unterschiedlichen Verteilung von Biomolekülen in einer organischen Phase, einer wässrigen Phase und der dazwischenliegenden Interphase. Hierzu zählen z. B. die Phenol-Chloroform-Extraktion, die Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol-Extraktion (im Volumenverhältnis 25:24:1)J. M. Graham, D. Rickwood: Subcellular Fractionation: A Practical Approach. Oxford University Press, 1997. ISBN 978-0-19-159161-7. und die Trizol-Extraktion.P. Chomczynski, N. Sacchi: Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. In: Anal Biochem. (1987) 162(1):156-9. PMID 2440339. Die DNA sammelt sich bei der Extraktion nach Sacchi (mit Trizol, TRI Reagent, Trisure, STAT-60, RNAzol oder DNAzolP. Chomczynski, K. Mackey, R. Drews, W. Wilfinger: DNAzol: a reagent for the rapid isolation of genomic DNA. In: BioTechniques. Band 22, Nummer 3, März 1997, S. 550–553, , PMID 9067036. als Handelsnamen und Varianten) in der Interphase, die RNA und die Kohlenhydrate in der wässrigen Phase und die Proteine und die Lipide in der organischen Phase. Dabei sorgt das Chaotrop Guanidiniumthiocyanat für eine Denaturierung aller Proteine, einschließlich DNasen, RNasen und Peptidasen. Die Interphase wird mit einer Pipette in ein neues Gefäß überführt. Anschließend wird die enthaltene DNA einer Ethanol- oder Isopropanolfällung unterzogen. Vorteile der Zwei-Phasen-Extraktion sind geringe Kosten und keine Notwendigkeit einer Zentrifuge. Die Nachteile sind die Verwendung giftiger und flüchtiger Reagenzien bzw. die Notwendigkeit einer Laborabzugshaube sowie erhöhter Zeitbedarf.
Adsorption an Silicagel mini|hochkant=0.5|Kommerziell erhältliche Kieselgelsäule, auf dem Kopf stehend mini|Austausch der an Kieselgel gebundenen Wassermoleküle (oben) gegen DNA (unten) Bei dieser Fällungsmethode und Festphasenextraktion wird die DNA in leicht saurer Umgebung an eine Matrix aus Kieselgel (),R. Boom, C. J. Sol, M. M. Salimans, C. L. Jansen, P. M. Wertheim-van Dillen, J. van der Noordaa: Rapid and simple method for purification of nucleic acids. In: Journal of clinical microbiology. Band 28, Nummer 3, März 1990, S. 495–503, . PMID 1691208. .R. Boom, C. Sol, M. Beld, J. Weel, J. Goudsmit, P. Wertheim-van Dillen: Improved silica-guanidiniumthiocyanate DNA isolation procedure based on selective binding of bovine alpha-casein to silica particles. In: Journal of clinical microbiology. Band 37, Nummer 3, März 1999, S. 615–619, . PMID 9986822. . Glaspuder,M. A. Marko, R. Chipperfield, H. C. Birnboim: A procedure for the large-scale isolation of highly purified plasmid DNA using alkaline extraction and binding to glass powder. In: Anal Biochem. (1982), Band 121(2), S. 382–7. PMID 6179438. GlasfaserfilterT. A. Borodina, H. Lehrach, A. V. Soldatov: DNA purification on homemade silica spin-columns. In: Anal Biochem. (2003), Band 321(1), S. 135–7. PMID 12963065. oder Diethyl-Aminoethyl-Dextran (DEAE-Dextran) adsorbiert. Dabei kann auch selektiv einzel- und doppelsträngige DNA getrennt werden.M. Beld, C. Sol, J. Goudsmit, R. Boom: Fractionation of nucleic acids into single-stranded and double-stranded forms. In: Nucleic acids research. Band 24, Nummer 13, Juli 1996, S. 2618–2619, . PMID 8692706. . Die Adsorption erfolgt unter DNA-fällenden Pufferbedingungen (mit Alkoholen und leicht saurem pH-Wert) bei Silica und Glasfaser über polare Wechselwirkungen, bei DEAE-Dextran durch ionische Wechselwirkungen. Die Probe kann mehrfach auf die Matrix aufgetragen werden, um die Ausbeute zu erhöhen. Anschließend wird die in der Chromatographiesäule enthaltene Matrix mit chaotropen Pufferlösungen von den verunreinigenden DNA-bindenden Proteinen befreit. Die chaotropen Salze denaturieren die Proteine und halten sie in Lösung, während die DNA an der Matrix gebunden bleibt. Bei einer chemischen Gelextraktion, also der Extraktion von DNA aus Agarosegelen durch Auflösung des Gels, wird oftmals als alternatives Chaotrop Natriumiodid verwendet.B. Vogelstein, D. Gillespie: Preparative and analytical purification of DNA from agarose. In: Proc Natl Acad Sci U S A. (1979), Band 76(2), S. 615–9. PMID 284385; . Die Elution der DNA von der Matrix erfolgt durch Zugabe von Wasser oder leicht basischem Tris-Puffer mit EDTA (TE-Puffer). Durch eine optionale zweite Elution wird die absolute extrahierte DNA-Menge zu Lasten der Konzentration erhöht. Nach der Elution der DNA von der Kieselgel-Matrix folgt meistens ebenfalls die Ethanolfällung. Vorteile der Adsorption sind der geringere Zeitaufwand und keine Notwendigkeit einer Abzugshaube. Nachteile sind höhere Kosten und die Notwendigkeit einer Zentrifuge. Es gibt Säulen, die zentrifugiert, durch Erdgravitation sedimentiert oder mit Vakuum abgesaugt werden. Bei magnetischen Varianten wird die Zentrifuge vermieden, indem die Matrix magnetische Partikel enthält, die mit einem Magneten sedimentiert werden können.S. C. Tan, B. C. Yiap: DNA, RNA, and protein extraction: the past and the present. In: Journal of biomedicine & biotechnology. Band 2009, 2009, S. 574398, , PMID 20011662, .
Lyse durch Kochen Bei einer Lyse durch Kochen (engl. ) werden bakterielle Zellen kurze Zeit nach Zugabe von Lysozym und Triton X-100 für 45 Sekunden gekocht, anschließend werden mit einem sterilen Zahnstocher die verklumpten Zelltrümmer (mit dem Großteil der chromosomalen DNA) entfernt.D. S. Holmes, M. A. Quigley: A rapid boiling method for the preparation of bacterial plasmids. In: Anal Biochem. (1981), Band 114, Nr. 1, S. 193–197. PMID 6269464.L. V. Andreou: Isolation of plasmid DNA from bacteria. In: Methods Enzymol. (2013), Band 529, S. 135–142. . PMID 24011041. Nach einer Zentrifugation wird der nun geklärte Überstand einer Ethanolfällung unterzogen. Diese Methode wird meistens zur Plasmidisolation aus Bakterien verwendet, da die chromosomale DNA mit anderen Bestandteilen verklumpt. Diese Methode eignet sich bei erhöhter Probenanzahl, erzeugt jedoch eine vergleichsweise etwas geringere Ausbeute und Reinheit, da Plasmide teilweise mit den verklumpten Bestandteilen entfernt werden und keine selektive Entfernung der Proteine erfolgt.
CTAB-Fällung