mini|Schematischer Aufbau einer Western Blot - Kammer mit markierter Anode und Kathode.
Western Blot (Westernblot) bezeichnet die Übertragung (engl. Blotting) von Proteinen auf eine Trägermembran, die anschließend über immunologische Reaktionen nachgewiesen werden können. Die Übertragung kann auf unterschiedliche Weise durchgeführt werden: mittels Diffusion, Kapillarwirkung oder Elektrophorese.A. Goldman, J. A. Ursitti, J. Mozdzanowski, D. W. Speicher: Electroblotting from Polyacrylamide Gels. In: Current protocols in protein science. Band 82, November 2015, S. 10.7.1–10.7.16, , PMID 26521711, . Anwendung findet der Western Blot in der biochemischen und medizinischen Forschung sowie in der Diagnostik, wodurch er zu den meistverwendeten proteinanalytischen Methoden gezählt wird. Der Western Blot gehört zur Gruppe der Immunblots.
Geschichte Die Western Blot-Methode wurde ursprünglich 1979 im Labor von Robert Nowinski im Fred Hutchinson Cancer Research Center in Seattle von W. Neal BurnetteRajendrani Mukhopadhyay: W. Neal Burnette: the man behind the Western Blot, ASBMB Today 2012. und unabhängig im Labor von George R. Stark an der Universität Stanford entwickelt.Jaime Renart, Jakob Reiser, George E. Stark: Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure. In: Proceedings of the National Academy of Sciences. Bd. 76, Nr. 7, 1979, S. 3116–3120, PMID 91164, . Im selben Jahr konnten Harry Towbin und Mitarbeiter das Verfahren wie im einfacheren Southern Blot auf Nitrocellulose umstellen,Harry Towbin, Theophil Staehelin, Julian Gordon: Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. In: Proceedings of the National Academy of Sciences. Bd. 76, Nr. 9, 1979, S. 4350–4354, PMID 388439, . was auch heutzutage die einfachere und präferierte Methode ist.
Die Bezeichnung des Blot-Verfahrens („Western Blot“) stammt vom englischen blot für Klecks oder Fleck und von engl. blotting paper für Löschpapier, bei dem auch ein identischer Abdruck des Originals entsteht. Diese wurde erstmals 1981 von Neal BurnetteW. Neal Burnette: „Western blotting“: electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. In: Analytical Biochemistry. Bd. 112, Nr. 2, 1981, S. 195–203, PMID 6266278, . als eine Allusion an Northern Blot und Southern Blot eingeführt (die Veröffentlichung erschien mit zwei Jahren Verspätung, da die Zeitschrift sie ursprünglich abgelehnt hatte).Citation's Classic: W. Neal Burnette (PDF; 234 kB) Edwin Southern gilt als der Erfinder der Blotting-Technik. Im Jahr 1975 entwickelte er eine Methode für die Auftrennung von DNA-Fragmenten und nachfolgende Hybridisierung, die ihm zu Ehren als Southern Blot bezeichnet wurde. Die entsprechende Auftrennung von RNA-Fragmenten wurde in Anlehnung an seinen Namen als Northern Blot bezeichnet. Daher nannte man das Proteinblotting mit SDS Western Blot. Zur Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen wurde der Far-Western-Blot entwickelt. Als Kombination des Western und des Southern Blot wurde zum Nachweis von DNA-Protein-Interaktionen der Southwestern Blot entwickelt, ebenso der Northwestern Blot zum Nachweis von RNA-Protein-Interaktionen.
Einen Eastern Blot per se gibt es nicht. Dennoch wird der Ausdruck „Eastern Blot“ für verschiedene Methoden in Anspruch genommen, z. B. für eine elektrophoretische Auftrennung und einen Transfer der Proteine auf Membranen mit einem kationischen Detergens (z. B. CTABEngelbert Buxbaum: Cationic electrophoresis and electrotransfer of membrane glycoproteins. In: Analytical Biochemistry. Bd. 314, Nr. 1, 2003, S. 70–76, PMID 12633604, .Dianne T. Akin, Raymond Shapira, Joseph M. Kinkade Jr.: The determination of molecular weights of biologically active proteins by cetyltrimethylammonium bromide-polyacrylamide gel electrophoresis. In: Analytical Biochemistry. Bd. 145, Nr. 1, 1985, S. 170–176, PMID 4003759, . bei der CTAB-PAGE oder 16-BACJoachim Hartinger, Katinka Stenius, Dagmar Högemann, Reinhard Jahn: 16-BAC/SDS-PAGE: a two-dimensional gel electrophoresis system suitable for the separation of integral membrane Proteins. In: Analytical Biochemistry. Bd. 240, Nr. 1, 1996, S. 126–133, PMID 8811889, . bei der BAC-PAGE), bei dem die Proteine in die entgegengesetzte Richtung (zur Kathode) wandern. Der Ausdruck Eastern Blot wurde auch für das Blotten von Lipiden auf Membranen (Far-Eastern-BlotDai Ishikawa, Takao Taki: Micro-scale Analysis of Lipids by Far-eastern Blot (TLC Blot). In: Journal of Japan Oil Chemists' Society. 47, 1998, S. 963, .), den Transfer nativer Proteine aus nichtdenaturierenden Gelen oder das Auftropfen (engl. ) von Molekülen verwendet.Hiroyuki Tanaka, Noriko Fukuda, Yukihiro Shoyama: Eastern blotting and immunoaffinity concentration using monoclonal antibody for ginseng saponins in the field of traditional chinese medicines. In: Journal of Agricultural and Food Chemistry. Bd. 55, Nr. 10, S. 3783–3787, PMID 17455950, .
Prinzip
Vor dem eigentlichen Western Blot wird ein Proteingemisch mit Hilfe einer Gel-Elektrophoresetechnik in einer Trägermatrix (SDS-PAGE, Nativ-PAGE, isoelektrische Fokussierung, 2D-Gelelektrophorese usw.) entsprechend ihrer Größe, Ladung oder anderer Eigenschaften aufgetrennt. Hierbei werden die zu untersuchenden Proteine zuerst per Gelelektrophorese (in der Regel ein Polyacrylamid-Gel mit optimaler Acrylamid-Konzentration) in Proteinbanden aufgetrennt.
Proteintransfer mini|Semi-Dry-Blotter für den Elektrotransfer mini|Tank-Blotter für den Elektrotransfer Beim Western Blot wird meistens ein senkrecht zum Polyacrylamid-Gel gerichtetes elektrisches Feld angelegt (Elektrotransfer), wodurch die mit SDS-beladenen und negativ geladenen Proteine in Richtung der Anode (Plus-Pol) wandern.A. Goldman, J. A. Ursitti, J. Mozdzanowski, D. W. Speicher: Electroblotting from Polyacrylamide Gels. In: Current protocols in protein science / editorial board, John E. Coligan.. [et al.]. Band 82, 2015, S. 10.7.1–10.7.16, , PMID 26521711. Sofern kein Zeitdruck besteht, kann der Transfer alternativ durch Kapillarwirkung in Richtung eines trockenen Stapels eines hydrophilen, adsorbierenden Materials erfolgen (Kapillartransfer) oder per Diffusion.B. T. Kurien, R. H. Scofield: Multiple Immunoblots by Passive Diffusion of Proteins from a Single SDS-PAGE Gel. In: Methods in Molecular Biology. Band 1312, 2015, S. 77–86, , PMID 26043992.
Beim Transfer wandern die Proteine aus dem Gel auf eine Membran, z. B. Nitrocellulose, Nylon, Glasfaser oder meistens Polyvinylidendifluorid (PVDF). PVDF-Membranen werden zuerst kurz in Methanol eingelegt, damit die Hydrophobie der Membran gemindert wird und der Transferpuffer in Kontakt mit der PVDF-Membran kommen kann. Bei Nylon oder PVDF bleiben Proteine aufgrund hydrophober und polarer Wechselwirkungen an der Membranoberfläche haften, während die Adsorption bei Nitrocellulose oder Glasfasern über ionische und polare Wechselwirkungen erfolgt.
Für einen Elektrotransfer wird die Membran anodenseitig auf das Gel gelegt und beidseitig mit Transferpuffer-benässten Filterpapieren belegt und zwischen die beiden Elektroden gelegt. Für den Elektrotransfer werden drei unterschiedliche Systeme verwendet: das Tank-Blot-System, das Semi-Dry-Blot-System und das Dry-Blot-System, die sich in Aufbau und eingesetzten Puffermengen und -systemen unterscheiden. Beim Elektrotransfer wird meistens ein elektrischer Strom von 2,5 mA/cm² der Blotmembran verwendet, d. h. bei einer Blotmembran von 10 cm × 10 cm Größe werden im Elektrophorese-Netzteil 250 mA eingestellt. Daneben gibt es noch den Kapillartransfer ohne eine Verwendung von elektrischem Strom, bei dem das Gel auf ein Transferpuffer-benässtes Filterpapier gelegt, auf das wiederum die Membran und zuletzt ein trockener Filterpapierstapel gelegt wird.
Beim Transfer bleibt das Muster der elektrophoretischen Auftrennung erhalten. Die Proteine sind nun aber für weitere Methoden zugänglich (z. B. Bindung eines Immunkonjugats). Nach diesem Vorgang kann das an den Proteinen angelagerte SDS ausgewaschen werden. Daher können die Proteine renaturieren und teilweise ihre Sekundär- und Tertiärstruktur wieder einnehmen, aufgrund der räumlichen Trennung der verschiedenen Untereinheiten eines Proteins kann die Quartärstruktur so jedoch nicht wiederhergestellt werden. Zur Bestimmung der Anzahl und Größe der Untereinheiten eines Proteins kann jedoch vor der SDS-PAGE eine kovalente Vernetzung der Untereinheiten durchgeführt werden, die ein Aufkochen in Probenpuffer für die SDS-PAGE übersteht und nach einer Immunfärbung den Aufbau eines Proteinkomplexes aufzeigen kann.
Proteindetektion mini|Ponceaurot-Färbelösung für Western Blot und Coomassie-Brillant-Blau-Färbelösung für SDS-PAGE mini|Blotmembran nach Proteintransfer und Ponceaufärbung aller Proteine. In der linken Spur ist ein vorgefärbter Proteinmarker aufgetrennt. mini|Strukturformel von Amidoschwarz, dessen Natriumsalz Amidoschwarz 10 B als Farbstoff eingesetzt wird