Thermostabile DNA-Polymerase

mini|Taq-DNA-Polymerase mit Exonuklease- (oben links) und Polymerasedomäne mit DNA (unten rechts)

Thermostabile DNA-Polymerasen sind DNA-Polymerasen, die von Thermophilen, zumeist Bakterien- oder Archaeenarten, entstammen und daher thermostabil sind. Sie werden zur Polymerasekettenreaktion und verwandten Methoden zur Vervielfältigung und Modifikation von DNA verwendet.

Eigenschaften Es wurden mehrere DNA-Polymerasen mit unterschiedlichen Eigenschaften beschrieben, die ihren spezifischen Einsatz bei einer PCR, einer Real-Time-PCR oder einer isothermen Amplifikation bestimmen. Als DNA-Polymerasen weisen die thermostabilen DNA-Polymerasen alle eine 5'→3'-Polymeraseaktivität sowie entweder eine 5'→3'- oder eine 3'→5'-Exonukleaseaktivität auf. + Eigenschaften thermostabiler DNA-Polymerasen Polymerase Taq Tth (Tfl)Tfl bezeichnet Thermus flavus, der keine offizielle Bezeichnung ist. Analysen der 16S rRNA haben Tfl als identisch mit Tth bestätigt. Bst Klenow-Fragment (BF) Tli (Vent) Deep Vent Pfx (KOD) Pfu (Pwo)Die DNA-Polymerase und die 16S rRNA von P. woesei sind identisch mit der von P. furiosus.OrganismusThermus aquaticusThermus thermophilusGeobacillus stearothermophilusFrüher als Bacillus bezeichnet, daher das „B“ in Bst.Thermococcus litoralisPyrococcus sp. GB-DZu Stamm GB-D existieren wenige Daten. Alle verfügbaren Sequenzen (U00707.1, AB022670.1) sind identisch mit Teilen des Genoms von Pyrococcus kukulkanii LMOA42.Thermococcus kodakarensisFrüher als Pyrococcus kodakarensis bezeichnet.Pyrococcus furiosusUrsprungbakteriellbakteriellbakteriellarchaeischarchaeischarchaeischarchaeischMolekulargewicht 80kDaPromega: Properties of Thermostable DNA Polymerases (PDF; 208 kB). Accessed september 27, 2012. 94kDa 67kDa 90kDa 90kDa 90kDa 92kDaBetriebstemperatur 74 °C 74 °C 65 °C 74 °C 75 °C 75 °C 75 °C5'→3'-Exonuklease-Aktivität Ja Ja Nein Nein Nein3'→5'-Exonuklease-Aktivität Nein Nein Nein Ja Ja Ja JaReverse-Transkriptase-Aktivität Schwach Ja Schwach Nein N/ADNA-Enden 3'-A 3'-A 3'-A 70 % ohne Überhang; 30 % Einzelbasen kein Überhang kein Überhang kein ÜberhangFehlerrate (Fehler pro Base und Verdopplung)8 × 10−61,5 × 10−43-5,6 × 10−51,5 × 10−52,8 × 10−62,7 × 10−64.0 × 10−63,5 × 10−61.2 × 10−57.6 × 10−61,3 × 10−6H.H. Hogrefe, M. Borns, High fidelity PCR enzymes, in: C.W. Dieffenbach, G.S. Dveksler (Eds.), PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2003.5.1 × 10−62.8 × 10−6Syntheserate (Basen/Sek.)21–4761Agilent: High-Fidelity PCR Enzymes: Properties and Error Rate Determinations.19123120106–1389,3–25Prozessivität (Basen)10–42<20>3006,4–20

Bakterielle Polymerasen Thermostabile DNA-Polymerasen natürlichen Ursprungs kommen unter anderem bei thermophilen Bakterien, Archaeen und deren Pathogenen vor. Unter den bakteriellen thermostabilen DNA-Polymerasen werden die Taq-Polymerase, die Tfl-Polymerase, die Tma-Polymerase, die Tne-Polymerase und die Tth-Polymerase verwendet.B. Villbrandt, H. Sobek, B. Frey, D. Schomburg: Domain exchange: chimeras of Thermus aquaticus DNA polymerase, Escherichia coli DNA polymerase I and Thermotoga neapolitana DNA polymerase. In: Protein Eng., Bd. 13, Nr. 9, 2000, S. 645–654. PMID 11054459.W. Abu Al-Soud, P. Râdström: Capacity of nine thermostable DNA polymerases to mediate DNA amplification in the presence of PCR-inhibiting samples. In: Appl. Environ. Microbiol., Bd. 64, Nr. 10, 1998, S. 3748–3753. PMID 9758794; .

Die zu den A-Typ-DNA-Polymerasen gehörenden bakteriellen thermostabilen DNA-Polymerasen besitzen neben der 5'→3'-Polymerase-Aktivität eine 5'→3'-Exonuklease-Aktivität und erzeugen am 3'-Ende des neu erzeugten Stranges einen Adenosin-Überhang (engl. ). Die Prozessivität (engl. ) beschreibt die durchschnittliche Anzahl an Basenpaaren, bevor eine Polymerase von der DNA-Vorlage (engl. ) abfällt. Die Prozessivität der verwendeten Polymerase begrenzt den maximalen Abstand des Primers zur Sonde in der real time quantitative PCR. Die Prozessivität einer Taq-Polymerase liegt bei etwa 200 Basenpaaren.

Archaeische Polymerasen mini|Pfu-Polymerase mit zwei Magnesiumionen (graue Kugeln) Häufig verwendete DNA-Polymerasen des B-Typs sind die aus verschiedenen Archaeen stammende Pfu-Polymerase,J. Cline, J. C. Braman, H. H. Hogrefe: PCR fidelity of pfu DNA polymerase and other thermostable DNA polymerases. In: Nucleic Acids Research., Bd. 24, Nr. 18, 1996, S. 3546–3551. PMID 8836181; . die Pwo-Polymerase, die KOD-Polymerase,M. Takagi, M. Nishioka, H. Kakihara, M. Kitabayashi, H. Inoue, B. Kawakami, M. Oka, T. Imanaka: Characterization of DNA polymerase from Pyrococcus sp. strain KOD1 and its application to PCR. In: Appl. Environ. Microbiol., Bd. 63, Nr. 11, 1997, S. 4504–4510. PMID 9361436; . die Tli-Polymerase (auch Vent genannt),H. Kong, R. B. Kucera, W. E. Jack: Characterization of a DNA polymerase from the hyperthermophile archaea Thermococcus litoralis. Vent DNA polymerase, steady state kinetics, thermal stability, processivity, strand displacement, and exonuclease activities. In: J Biol Chem., Bd. 268, Nr. 3, 1993, S. 1965–1975. PMID 8420970. die Tag-Polymerase,K. Böhlke, F. M. Pisani, C. E. Vorgias, B. Frey, H. Sobek, M. Rossi, G. Antranikian: PCR performance of the B-type DNA polymerase from the thermophilic euryarchaeon Thermococcus aggregans improved by mutations in the Y-GG/A motif. In: Nucleic Acids Res., Bd. 28, Nr. 20, 2000, S. 3910–3917. PMID 11024170; . die Tce-Polymerase,K. P. Kim, H. Bae, I. H. Kim, S. T. Kwon: Cloning, expression, and PCR application of DNA polymerase from the hyperthermophilic archaeon, Thermococcus celer. In: Biotechnol Lett. (2011), Bd. 33(2), S. 339–46. PMID 20953664. die Tgo-Polymerase, die TNA1-Polymerase,Y. Cho, H. S. Lee, Y. J. Kim, S. G. Kang, S. J. Kim, J. H. Lee: Characterization of a dUTPase from the hyperthermophilic archaeon Thermococcus onnurineus NA1 and its application in polymerase chain reaction amplification. In: Mar Biotechnol (NY), Bd. 9, Nr. 4, 2007, S. 450–458. PMID 17549447. die Tpe-Polymerase,J. I. Lee, Y. J. Kim, H. Bae, S. S. Cho, J. H. Lee, S. T. Kwon: Biochemical properties and PCR performance of a family B DNA polymerase from hyperthermophilic euryarchaeon Thermococcus peptonophilus. In: Appl Biochem Biotechnol., Bd. 160, Nr. 6, 2010, S. 1585–1899. PMID 19440663. die Tthi-Polymerase,D. Marsic, J. M. Flaman, J. D. Ng: New DNA polymerase from the hyperthermophilic marine archaeon Thermococcus thioreducens. In: Extremophiles, Bd. 12, Nr. 6, 2008, S. 775–788. PMID 18670731. die Neq-PolymeraseJ. G. Song, E. J. Kil, S. S. Cho, I. H. Kim, S. T. Kwon: An amino acid residue in the middle of the fingers subdomain is involved in Neq DNA polymerase processivity: enhanced processivity of engineered Neq DNA polymerase and its PCR application. In: Protein Eng. Des. Sel., Bd. 23, Nr. 11, 2010, S. 835–842. PMID 20851826. und die Pab-Polymerase.J. Dietrich, P. Schmitt, M. Zieger, B. Preve, J. L. Rolland, H. Chaabihi, Y. Gueguen: PCR performance of the highly thermostable proof-reading B-type DNA polymerase from Pyrococcus abyssi. In: FEMS Microbiol Lett., Bd. 217, Nr. 1, 2002, S. 89–94. PMID 12445650.

Die zum B-Typ gehörenden Archaeen-Varianten erzeugen keinen Überhang (engl. , die Tli-Polymerase macht bei etwa 30 % der Produkte einen Überhang) und besitzen anstatt der 5'→3'-Exonuklease-Aktivität eine Aktivität zur Korrektur von Synthesefehlern (engl. ), die 3'→5'-Exonuklease-Aktivität.E. M. Kennedy, C. Hergott, S. Dewhurst, B. Kim: The mechanistic architecture of thermostable Pyrococcus furiosus family B DNA polymerase motif A and its interaction with the dNTP substrate. In: Biochemistry (2009), Bd. 48(47), S. 11161–8. PMID 19817489; .T. Kuroita, H. Matsumura, N. Yokota, M. Kitabayashi, H. Hashimoto, T. Inoue, T. Imanaka, Y. Kai: Structural mechanism for coordination of proofreading and polymerase activities in archaeal DNA polymerases. In: J Mol Biol. (2005), Bd. 351(2), S. 291–8. PMID 16019029. Bei den archaeischen Polymerasen leidet bei der Erzeugung eines analogen Klenow-Fragments die Fehlerrate, da die korrigierende Exonuklease-Aktivität dabei entfernt wird. Manche DNA-Polymerasen von Archaeen zeichnen sich weniger durch ihre Eignung zur Standard-PCR aus, sondern durch ihre verminderte Hemmung bei der Amplifikation von aDNA.J. P. McDonald, A. Hall, D. Gasparutto, J. Cadet, J. Ballantyne, R. Woodgate: Novel thermostable Y-family polymerases: applications for the PCR amplification of damaged or ancient DNAs. In: Nucleic Acids Res. (2006), Bd. 34(4), S. 1102–11. PMID 16488882; .

Modifizierte Polymerasen Durch Proteindesign wurde aus verschiedenen thermostabilen Polymerasen und der DNA-Klammer des thermostabilen DNA-bindenden Proteins SSo7d verschiedene Fusionsproteine mit der niedrigen Fehlerrate archaeischer und der hohen Syntheserate bakterieller thermostabiler DNA-Polymerasen erzeugt (Q5-Polymerase).Y. Wang, D. E. Prosen, L. Mei, J. C. Sullivan, M. Finney, P. B. Vander Horn: A novel strategy to engineer DNA polymerases for enhanced processivity and improved performance in vitro. In: Nucleic Acids Res. (2004), Bd. 32(3), S. 1197–207. PMID 14973201; . Auch wurde ein Fusionsprotein des PCNA-Homologs aus Archaeoglobus fulgidus mit archaeischen thermostabilen DNA-Polymerasen erzeugt.M. Motz, I. Kober, C. Girardot, E. Loeser, U. Bauer, M. Albers, G. Moeckel, E. Minch, H. Voss, C. Kilger, M. Koegl: Elucidation of an archaeal replication protein network to generate enhanced PCR enzymes. In: J Biol Chem. (2002), Band 277(18), S. 16179–88. PMID 11805086. PDF. Analog wurden Fusionsproteine thermostabiler DNA-Polymerasen mit der thermostabilen DNA-bindenden Proteindomäne einer Topoisomerase (vom Typ V, mit Helix-hairpin-Helix-Motiv, HhH) aus Methanopyrus kandleri erzeugt (TopoTaq und PfuC2). Ebenfalls durch Proteindesign wurde eine modifizierte Pfu-Polymerase erzeugt (Pfu Ultra).Holly H. Hogrefe, M. Borns: High fidelity PCR enzymes. In: C.W. Dieffenbach, G.S. Dveksler (Hrsg.): PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2003. Ähnliche Effekte werden auch mit Mischungen thermostabiler DNA-Polymerasen beider Typen mit einem Mischungsverhältnis der Enzymaktivitäten der Polymerasen des Typs A und B von 30 zu 1 erzielt,W. M. Barnes: PCR amplification of up to 35-kb DNA with high fidelity and high yield from lambda bacteriophage templates. In: Proc Natl Acad Sci U S A (1994), Bd. 91(6), S. 2216–20. PMID 8134376; . z. B. die Herculase als kommerzielle Mischung der Taq- und der Pfu-Polymerase.

Die Basissyntheseraten verschiedener Polymerasen (engl. ) sind verglichen worden. Die Syntheserate der Taq-Polymerase liegt bei etwa 60 Basenpaaren pro Sekunde. Unter den unmodifizierten thermostabilen DNA-Polymerasen liegt nur die Syntheserate der KOD-Polymerase über 100 Basenpaaren pro Sekunde (circa 120 bp/s). Unter den modifizierten thermostabilen DNA-Polymerasen sind verschiedene Mutationen beschrieben worden, die die Syntheserate steigern. Die KOD-Polymerase und einige modifizierte thermostabile DNA-Polymerasen (iProof, Pfu Ultra, Phusion, Velocity oder Z-Taq) werden aufgrund ihrer hohen Syntheserate zu einer PCR-Variante mit kürzeren Amplifikationszyklen eingesetzt (Fast-PCR, High-speed PCR).

Die Fehlerraten verschiedener Polymerasen (engl. ) sind bekannt und beschrieben worden. Die Fehlerrate der Taq-Polymerase beträgt 8 · 10−6 Fehler pro Basenpaar, die der KOD-Polymerase 3,5 · 10−6 Fehler pro Basenpaar, die der Tli-Polymerase und der Herculase 2,8 · 10−6 Fehler pro Basenpaar, die der Pfu-Polymerase 1,3 · 10−6 Fehler pro Basenpaar und die der Pfu Ultra 4,3 · 10−7 Fehler pro Basenpaar.