mini|Haarnadelstruktur einer pre-microRNA
microRNA (von ‚klein‘), abgekürzt miRNA oder miR, sind kurze, hochkonservierte, nichtcodierende Ribonukleinsäuren, die eine wichtige Rolle im komplexen Netz der Genregulation spielen, insbesondere beim Gen-Silencing. MicroRNAs regulieren die Genexpression hochspezifisch auf der post-transkriptionalen Ebene.L. He, G. J. Hannon: MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation. In: Nat. Rev. Genet. Band 5, Nr. 7, 2004, S. 522–531. PMID 15211354 Im Allgemeinen weisen microRNAs eine Größe von 21 bis 23 Nukleotiden (nt) auf, doch können es sogar einige Hundert sein (siehe Abbildung). Im Jahr 1993 entdeckten die US-amerikanischen Biologen Victor Ambros und Gary Ruvkun die microRNA (let-7 an C. elegans), wofür sie im Jahr 2024 den Nobelpreis für Medizin erhielten.
Geschichte 1993 wurden erstmals regulierende kleine RNAs beschrieben,R. Lee, R. L. Feinbaum, V. Ambros: The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. In: Cell. Band 75, Nr. 5, 1993, S. 843–854. PMID 8252621 der Name microRNA wurde jedoch erst 2001 geprägt.G. Ruvkun: Molecular biology. Glimpses of a tiny RNA world. In: Science. Band 294, Nr. 5543, 2001, S. 797–799. PMID 11679654R. Lee u. a.: A short history of a short RNA. In: Cell. Band 116, Supplement 2, 2004, S. 89–92. PMID 15055592 Im Nematoden Caenorhabditis elegans codierte das Gen lin-4 überraschenderweise nicht für ein Protein, sondern für zwei kleine RNA-Moleküle mit einer Länge von ungefähr 60 nt und ca. 20 nt. Das längere Molekül stellt nach heutigem Kenntnisstand die pre-microRNA dar. Bei dem Molekül mit ca. 20 Nukleotiden handelt es sich um die reife microRNA. Diese kleinere RNA lin-4 reguliert das Gen lin-14, indem sie sich durch Basenpaarung komplementär an die 3'-UTR der lin-14-mRNA bindet und damit die Translation der mRNA vermindert. Mit der Entdeckung einer weiteren miRNA (let-7) konnte gezeigt werden, dass es sich nicht um ein außergewöhnliches Phänomen bei C. elegans handelt. Let-7 reguliert das Gen lin-41;B. J. Reinhart u. a.: The 21-nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans. Nature, 403(6772), 2000, S. 901–906. PMID 10706289 die Gene let-7 und lin-41 sind evolutionär hochkonserviert. Der Mechanismus der microRNA-Regulation ist auch bei anderen multizellulären Organismen anzutreffen.E. Wienholds, R.H. Plasterk: MicroRNA function in animal development. In: FEBS Lett. Band 579, Nr. 26, 2005, S. 5911–5922. PMID 16111679 In den letzten Jahren sind die Erkenntnisse über microRNAs stetig gewachsen. Die Datenbank miRBase zeigte einen Zuwachs von über 4000 Sequenzen innerhalb von zwei Jahren. Auch verzeichnet die Datenbank Pubmed einen starken Anstieg der Veröffentlichungen zum Thema microRNAs. Die genauen biologischen Funktionen der meisten microRNAs sind aber noch nicht bekannt. Nach computerbasierten Vorhersagen könnten etwa 20–30 % der Gene im menschlichen Genom durch microRNAs reguliert sein.B. P. Lewis u. a.: Conserved seed pairing, often flanked by adenosines, indicates that thousands of human genes are microRNA targets. In: Cell. Band 120, Nr. 1, 2005, S. 15–20. PMID 15652477X. Xie u. a.: Systematic discovery of regulatory motifs in human promoters and 3’ UTRs by comparison of several mammals. In: Nature. Band 434, Nr. 7031, 2005, S. 338–345. PMID 15735639 Es darf angenommen werden, dass bis einige Tausend unterschiedliche microRNAs codiert werden.
Biogenese Die Transkription und Wirkung ist am Beispiel der Säugetiere beschrieben. Mit Abweichungen, z. B. bei den beteiligten Proteinkomponenten, ist der Wirk-Mechanismus in den verschiedenen Spezies vergleichbar. Die Gene für die miRNAs befinden sich im Genom, sie werden von einer RNA-Polymerase II oder III transkribiert. Das entstandene Primärtranskript hat eine Länge von 500 bis 3000 Nukleotiden und trägt den üblichen Poly-A-Schwanz am 3'-Ende sowie ein 7-Methylguanosin-Cap am 5'-Ende. Das Primärtranskript heißt primary microRNA (pri-miRNA) und lagert sich zu einer Schleife zusammen. Die RNase III (Drosha) und das dsRNA-Bindeprotein DGCR8 (entspricht Pasha bei Drosophila melanogaster) formen einen Mikroprozessor-Komplex, durch den im Kern einer Zelle die pri-miRNA zu einer etwa 70–80 Nukleotide großen precursor microRNA (pre-miRNA) prozessiert wird. Die pre-miRNA formt dabei eine charakteristische Haarnadelstruktur (hairpin). Die pre-miRNA wird durch Exportin-5 in Anwesenheit von Ran-GTP als Kofaktor über die Kernporen der Kernmembran aktiv in das Cytoplasma exportiert. Im Zytoplasma werden die pre-miRNAs durch das RNAse-III-Enzym Dicer in 17–24 nt lange ds-miRNAs geschnitten. Dicer interagiert mit dem ds-RNA-Bindeprotein TRBP (RDE-4 in C. elegans und Loquacious in Drosophila melanogaster). Dicer lädt die noch immer doppelsträngige miRNA auf ein Protein namens Argonaut 2 (AGO2), wodurch der RNA-induced silencing complex-loading complex gebildet wird, der aus Dicer, TRBP und AGO2 besteht. AGO2 entfernt einen Strang, den Passagierstrang, und bildet mit dem miRNA-Leitstrang den RNA-induced silencing complex (miRISC). Sobald RISC sich gebildet hat, spürt er seine Ziel-mRNA auf, indem er nach Übereinstimmungen der Basensequenzen sucht. Damit es zur Interaktion von RISC oder Ziel-mRNA kommen kann, bedarf es einer Komplementarität bei ca. 7 Basenpaaren, wobei vor allem die Nucleotide 2–8, vom 5‘-Ende der miRNA betrachtet, wichtig sind. Eine höhere Komplementarität verbessert die Bindung.
Wie genau AGO2 den miRNA-Leitstrang auswählt und „weiß“, welcher Strang abgebaut werden soll, ist noch unklar. Es ist jedoch bekannt, dass die Auswahl gezielt erfolgt. Zwei Faktoren scheinen eine besonders wichtige Rolle zu spielen: Erstens ist wichtig, welche Nucleobase am 5’-Ende steht, wobei Uracil bevorzugt wird. Zweitens kann der Strang, der ein thermodynamisch instabiles 5’-Ende besitzt, einfacher vom RISC aufgenommen werden. Abhängig davon bildet der miRNA-Strang mit dem 5’-Terminus an seinem Ende die reife miRNA, die auch guide RNA genannt wird. Der Passagierstrang wird in Annotation mit einem Stern markiert. Diese miRNA* kann möglicherweise in wenigen Fällen auch regulatorisch wirken.
Die Auswahl jener mRNA, die abgebaut werden soll, erfolgt nach Komplementarität mit der miRNA. Je mehr Basen von mRNA und miRNA komplementär sind, desto besser funktioniert die Repression der Translation. Außerdem binden die miRNAs bevorzugt an die 3’-UTR (untranslated region) der mRNA. Wenn RISC am 3‘-Ende der mRNA andockt, hat er mehr Zeit für die Repression der Translation – und die Zeit ist ein großer Faktor, da die mRNA rasch im Cytosol translatiert wird.
Die reife miRNA wird in einen Ribonukleoproteinkomplex aufgenommen (miRNP), der eine große Ähnlichkeit zum RISC-Komplex des RNAi-Pathways aufweist. Durch diesen miRISC Komplex kann die Aktivität der Zielgene durch zwei Methoden herunterreguliert werden. Die Wirkmechanismen der microRNAs und der sogenannten small interfering RNAs (siRNAs) weisen deutliche Parallelen auf. siRNAs werden von der RNase III Dicer aus langen doppelsträngigen RNAs (dsRNAs) prozessiert und als 21–28 nt lange einzelsträngige RNAs in den siRISC-Komplex aufgenommen. Dieser Komplex vermittelt die mRNA-Degradation.K. Okamura, E. C. Lai: Endogenous small interfering RNAs in animals. In: Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. Band 9, Nr. 9, 2008, S. 673–678. PMID 18719707 Mechanismus der Genregulation Die Genregulation erfolgt bei Tieren durch Bindung der microRNAs an die 3’ untranslatierte Region (3’-UTR) der mRNA von Zielgenen, die je nach Komplementarität der Bindesequenz und der beteiligten Proteine entweder an der Translation gehemmt oder durch Zerschneiden abgebaut werden. RISC stehen im Wesentlichen drei Möglichkeiten zur Verfügung, die Genexpression zu regulieren: a) die Inhibition der Translation mit anschließendem Abbau der mRNA, b) die Inhibition ohne deren Abbau sowie c) der direkte Abbau der mRNA, bevor die Translation initiiert wird.
Die Inhibition der Translation (Varianten a und b) ist häufiger als der direkte Abbau des mRNA-Strangs (Variante c), da die Varianten a und b eine geringere Komplementarität mit der Ziel-mRNA verlangen. Das am breitesten akzeptierte Modell für miRNA-vermitteltes silencing ist, dass es zuerst zur Inhibition der Translation kommt, gefolgt vom Abbau der mRNA.
Bei Variante a reicht die mRNA-miRNA Komplementarität nicht aus, damit AGO2 die mRNA eigenhändig abbauen kann. Daher müssen weitere Proteine rekrutiert werden. Federführend ist dabei GW182, das Decapping- und Deadenylierungsfaktoren rekrutiert. Durch Entfernen der Cap-Struktur und des Poly(A)Schwanzes wird die mRNA stark destabilisiert. Ein dritter Proteinkomplex, XNR1 genannt, baut die mRNA anschließend in 5‘-3‘-Richtung ab.
Variante b, die Translationsinhibition ohne mRNA-Abbau, ist komplizierter und die ausgearbeiteten Mechanismen bedürfen noch experimenteller Validierung. Ein Mechanismus, der postuliert wird, beinhaltet zwei wichtige Initiationsfaktoren (eIF4E und eIF4G). Sie werden durch RISC inhibiert und dissoziieren von der Translationsmaschinerie. Ohne sie kann die kleine ribosomale Untereinheit nicht an die 5‘-Cap-Struktur binden – der mRNA-Strang wird nicht translatiert. Variante a scheint häufiger als b zu sein.
Seltener kommt es zum direkten Abbau des mRNA-Strangs durch RISC. Dafür muss die miRNA weitreichend, wenn nicht gar vollständig komplementär mit der mRNA sein, was beim Menschen anders als bei Pflanzen unüblich ist. Die meisten miRNAs haben sich evolutiv so entwickelt, dass sie eben nicht perfekt komplementär sind, damit sie mehr Gene regulieren können. Es handelt sich um einen Kompromiss zwischen Genauigkeit und Effizienz.
Eine weitere RNA-Klasse, die ebenfalls über RNAi die Genexpression regulieren, sind die small interfering RNAs (siRNAs). Weil miRNAs und siRNAs sehr ähnlich prozessiert werden und auswechselbare biochemische Funktionen haben, ist die Unterscheidung nicht ganz einfach. miRNAs entstehen aus Haarnadel-artigen Strukturen. siRNAs hingegen entstammen einer langen RNA-Vorlage (dsRNA), aus der dann mehrere siRNAs gewonnen werden können. Aus einer Haarnadel kann immer nur eine miRNA extrahiert werden. Ein weiterer, äußerst relevanter Unterschied ist die Spezifität. Während siRNAs immer nur an eine mRNA andocken können, haben miRNAs oft mehrere Ziele (durchschnittlich 200 mRNAs). Dieser Umstand liegt in der imperfekten Komplementarität der miRNAs begründet: Sie können an eine mRNA andocken, obgleich einige Basen nicht komplementär sind – das geht bei siRNAs nicht. Während siRNAs den (irreversiblen) Abbau der mRNA herbeiführen, können miRNAs die Translation temporär unterdrücken und dissoziieren, wenn das Protein dann doch benötigt wird.