mini|2D-Gel (Autoradiogramm) mini|2D-Gele (Coomassie gefärbt) Die zweidimensionale Gelelektrophorese oder 2D-Gelelektrophorese ist eine analytische Methode in Biochemie, Molekularbiologie und Proteomik, konkret eine Variante der Gelelektrophorese. Sie wurde 1975 durch O’FarrellP. H. O’Farrell: High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. In: J. Biol. Chem. 250, 1975, S. 4007–4021. PMID 236308; (freier Volltextzugriff) und KloseJ. Klose: Protein mapping by combined isoelectric focusing and electrophoresis in mouse tissues. A novel approach to testing for induced point mutations in mammals. In: Humangenetik. 26, 1975, S. 231–243. PMID 1093965 unabhängig voneinander entwickelt. Sie kombiniert die isoelektrische Fokussierung (IEF) mit der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) zur Trennung komplexer Proteingemische (Bakterienlysate, Lysate von höheren Zellen oder Geweben, Körperflüssigkeiten) in Einzelproteine. Durch die Kombination der beiden orthogonal zueinander ausgeführten Trenntechniken wird eine besonders hochauflösende Trennung erreicht.
Jeder Fleck (Spot) im Proteinmuster entspricht einer Sorte (Spezies) von Proteinmolekülen. Da sich Proteinmuster in biologischen Systemen umwelt- und zustandsabhängig verändern, können sie zur Unterscheidung geschädigter und gesunder oder auch optimal und suboptimal gewachsener Zellen herangezogen werden. Sie geben beispielsweise Aufschluss über Krankheitsursachen oder den Wirkungsmechanismus von Medikamenten auf molekularer Ebene. Aufgrund der Komplexität von zweidimensionalen Proteinmustern wird für deren Auswertung auf speziell entwickelte Computerprogramme zurückgegriffen.
Probenvorbereitung Die Gewinnung und Verarbeitung der Probe erfolgt unter möglichst identischen Bedingungen. Damit wird ausgeschlossen, dass neben den zu untersuchenden experimentellen Variablen verfälschende Einflüsse auf die Probe einwirken. Aus extrazellulären Kompartimenten (sezernierte Proteine) werden die Proteine meist gefällt. Intrazelluläre Proteine extrahiert man durch schonende Zerstörung der Zellstrukturen und eine teilweise Proteinreinigung. Außerhalb ihrer natürlichen Umgebung sind die Proteine besonders anfällig für die Bildung von Proteinaggregaten und den Abbau durch Proteasen. Ferner wird bei der Probenvorbereitung bei 4 °C gearbeitet. In der Regel werden Harnstoff als Chaotrop und nichtionische Detergentien sowie proteasehemmende Stoffe zugesetzt,Thierry Rabilloud: Two-Dimensional Electrophoresis Protocols. Humana Springer, 2009, ISBN 978-1-58829-937-6. (PDF; 174 kB) um Wechselwirkungen und Veränderungen der Proteine zu vermeiden.
Erste Dimension (IEF) Während der IEF (erste Dimension) wird der Proteinextrakt in einem pH-Gradienten-Gel im elektrischen Feld eindimensional aufgetrennt. Die sauren und basischen Aminosäurereste der Proteine durchlaufen in Abhängigkeit vom Umgebungs-pH-Wert verschiedene (De)protonierungszustände und bestimmen so die Ladung des Proteins. Damit sind sie für die Wirkung des elektrischen Feldes auf die Proteine verantwortlich. Am isoelektrischen Punkt (pI) heben sich positive und negative Ladungen des Proteins auf. Der pI entspricht dem pH-Wert an dem das Protein eine Nettoladung von 0 besitzt. Es findet keine Kraftwirkung des elektrischen Feldes auf das nun ladungsneutrale Protein mehr statt und das Protein lagert sich ab. Durch Diffusion verursachte Ortsveränderungen in benachbarte pH-Bereiche führen zur erneuten elektrischen Ladung des Proteins. Das wieder wirksame elektrische Feld jedoch fördert das Protein sofort zurück an seinem isoelektrischen Punkt. Zwei verschiedene IEF-Technologien stehen zur Verfügung. Immobilisierte pH-Gradienten (IPG): Der Gelstreifen besteht aus einer Polyacrylamidmatrix. In diese Matrix werden sogenannte Immobiline einpolymerisiert. Immobiline sind Acrylamidderivate mit funktionellen Gruppen für schwache Säuren oder Base, mit definiertem pK-Wert. Durch die Kopolymerisation des neutralen Acrylamids mit den im Gradienten zugesetzten sauren und basischen Immobilinen entsteht ein unveränderlicher imobiler pH-Gradient.A. Görg, C. Obermaier, G. Boguth, A. Harder, B. Scheibe, R. Wildgruber, W. Weiss: The current state of two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients. In: Electrophoresis. 21(6), Apr 2000, S. 1037–1053. PMID 10786879R. Westermeier, W. Postel, J. Weser, A. Görg: High-resolution two-dimensional electrophoresis with isoelectric focusing in immobilized pH gradients. In: J Biochem Biophys Methods. 8(4), Dez 1983, S. 321–330. PMID 6663005 pH-Gradienten auf Basis von Trägerampholyten: Trägerampholyte sind synthetische Aminosäuren und liegen in einem Gelstreifen oder einem langen zylindrischen Gel (meist in einem Röhrchen) frei beweglich vor. Beim Anlegen eines elektrischen Feldes formen sie einen pH-Gradienten, der allerdings zeitinstabil ist. Mit zunehmender Zeit wandern die den Gradienten definierenden Ladungsträger zu den Gelenden und verformen über kurz oder lang dessen Verlauf. mini|zentriert|Zunächst leeres Gel, dann beladenes Gel, zuletzt fertiges Gel
Weiterhin kann als erste Dimension alternativ eine Polyacrylamid-Gelelektrophorese mit einem kationischen Detergens wie 16-BACJoachim Hartinger, Katinka Stenius, Dagmar Högemann, Reinhard Jahn: 16-BAC/SDS-PAGE: a two-dimensional gel electrophoresis system suitable for the separation of integral membrane Proteins. In: Analytical Biochemistry. Band 240, Nr. 1, 1996, S. 126–133. PMID 8811889, doi:10.1006/abio.1996.0339.R. P. Zahedi, J. Moebius, A. Sickmann: Two-dimensional BAC/SDS-PAGE for membrane proteomics. In: Sub-cellular biochemistry. Band 43, 2007, S. 13–20. PMID 17953388. oder 16-BAC und CTABR. J. Braun, N. Kinkl, M. Beer, M. Ueffing: Two-dimensional electrophoresis of membrane proteins. In: Analytical and bioanalytical chemistry. Band 389, Nummer 4, Oktober 2007, S. 1033–1045, , PMID 17680235 (Review). durchgeführt werden.
Äquilibrierung Bei der sogenannten Äquilibrierung, die sich der Trennung nach dem pI anschließt, wird das Gel mit den Proteinen vorerst reduziert (beispielsweise mit Mercaptoethanol oder Dithiothreitol). Dies dient der Beseitigung von Disulfidbrücken. Um eine Reoxidation der dabei entstandenen -SH HS-Gruppen zu Disulfid(-S-S-)Gruppen zu verhindern, werden im nächsten Schritt die HS-Gruppen z. B. mit Iodacetamid alkyliert. Schlussendlich werden die Proteine mit Natriumdodecylsulfat (sodium dodecyl sulphate – SDS) beladen. SDS ist ein negativ geladenes Detergenz. Pro 3 Aminosäuren bindet sich ca. ein SDS-Molekül über sein aliphatisches Ende durch hydrophobe Wechselwirkung an das Proteinmolekül. Mit der negativ geladenen Seite stößt es sich von den geladenen Enden in der Nachbarschaft gebundener SDS-Moleküle ab. Dies führt zur völligen Entfaltung (Linearisierung) der Proteinmoleküle. Je größer ein Proteinmolekül ist, desto länger sind die entstehenden mit SDS beladenen Ketten. Da abhängig von der Länge des Proteins sehr viele negativ geladene SDS-Moleküle binden, kann die Eigenladung für die meisten Proteine im Weiteren vernachlässigt werden.
Zweite Dimension (SDS-PAGE) Der Gelstreifen mit den nach dem pH-Wert aufgetrennten und äquilibrierten Proteinen wird bei vertikalen Systemen auf die Kante eines quadratischen bzw. rechteckigen ebenfalls SDS-haltigen Polyacrylamidgels gelegt. Bei horizontalen Systemen wird der Gelstreifen dagegen einige Millimeter vom Gelrand entfernt auf das flache SDS-Gel gelegt. Die Proteine werden nun senkrecht zur ersten Dimension in einer zweiten Elektrophorese nach ihrer Größe getrennt. Beim Anlegen des elektrischen Feldes (Anode gegenüber vom IEF-Gelstreifen) wandern die entfalteten und von SDS umgebenen Proteine mit ihrem Überschuss negativer Ladungen durch das Gel, welches den Proteinen entsprechend ihrer Molekülgröße einen mehr oder minder großen Widerstand entgegensetzt. Kleine Moleküle wandern relativ ungestört und erreichen schnell die dem IEF-Gel abgewandte Gelkante, große Moleküle werden bei der Wanderung ständig vom Gel gebremst und kommen kaum voran. Die Trennung in der zweiten Dimension wird mit Ankunft der kleinen Proteine am, dem IEF-Gel abgewandten, Gelrand gestoppt. Sichtbar wird dies durch einen mitlaufenden Farbstoff, wie zum Beispiel Bromphenolblau. Dieser kann bereits bei der Äquilibrierung zugegeben werden. Damit das Proteinmuster nach erfolgter Trennung vorhanden bleibt, muss es in einem anschließenden Schritt fixiert werden. Dazu werden verschiedene Alkohole (Methanol oder Ethanol) und Essigsäure genutzt. Diese denaturieren die getrennten Proteine und entfernt das Tensid, wodurch die Proteine unlöslich werden. Dadurch wird Diffusion verhindert und das 2D Muster wird somit zeitstabil.
Die Proteine markieren und detektieren
Markierung in der lebenden Zelle (in vivo) Parameter wie die Produktion von Proteinen in einem bestimmten Zeitraum (Proteinsyntheserate) oder die Phosphorylierung von Proteinen pro Zeitspanne werden bevorzugt durch den Einbau von (radioaktiven) Isotopen bestimmt. Dazu wird der Bakterien/Zellkultur ein Nährstoffsubstrat mit einem außergewöhnlichen Isotop verabreicht, welches dann in die Proteine (35S) oder in die Phosphatgruppen phosphorylierter (32/33P) Proteine eingebaut wird. Wird die Zeitspanne des Einbaus relativ kurz gewählt, ist im Ergebnis eher eine Momentaufnahme des zellulären Geschehens erfassbar, bei langer Zeitspanne eher das kumulierte Bild vieler Einzelereignisse. Der Proteinextrakt der markierten Zellen wird separiert und der Anteil der markierten Proteine über Autoradiographie oder massenspektrometrische Verfahren im 2D Muster bestimmt. Eine metabolische Markierung kann auch mit chemisch modifizierten Aminosäuren erfolgen, welche für die spätere Markierung mit Fluoreszenzfarbstoffen mit einem biologisch inerten Linker ausgerüstet wurden (Bioorthogonale Markierung). Zur Bestimmung der akkumulierten Proteinmenge kann neben einer dauernden metabolischen oder Isotopenmarkierung auch auf eines der folgend erklärten Verfahren zurückgegriffen werden.
Markierung vor der gelelektrophoretischen Trennung Besonders um mehrere Proben auf einem 2D-Gel zu trennen, werden kovalent bindende Fluoreszenzfarbstoffe eingesetzt. Dazu werden maximal drei verschiedene Proteinextrakte mit je einem Farbstoff markiert, gemischt und gemeinsam auf demselben Gel getrennt. Da die Farbstoffe separat voneinander detektiert werden können, ist die Generierung und der differentielle Vergleich dreier probenspezifischer Proteinmuster möglich (Difference Gel Electrophoresis, DIGE). Problematisch ist die Massenbeeinflussung der Proteine durch den gebundenen Farbstoff. Zudem sind die Farbstoffe relativ instabil und teuer.
Verwendet werden: Cy2; Cy3; Cy5 Flashpro Farbstoffe G-Dyes
Markierung bzw. Färbung nach der Trennung Die klassischen Proteinfärbungen erfolgen nach der elektrophoretischen Trennung. Eine Mengenbestimmung kann bei den nicht-linearen Färbeverfahren nur näherungsweise durch Versetzen der Probe mit Proteinen bekannter Konzentrationen erfolgen (z. B. ein Komigrationsstandard). Je nach gewünschter Spezifität und Sensitivität werden eingesetzt:
Adsorptionsfarbstoffe Coomassie-Brillant-Blau – Proteinmenge / nicht linear colloidal Coomassie-Brillant-Blau – Proteinmenge / nicht linear Silberfärbung – Proteinmenge / nicht linear / hoch sensitiv negative Zink Färbung – Proteinmenge / nicht linear / wenig sensitiv
Fluoreszenzfarbstoffe SYPRO Ruby – Proteinmenge / linear / sensitiv Krypton-Färbung – Proteinmenge Flamingo-Färbung – Proteinmenge / linear / hoch sensitiv DeepPurple-Färbung – Proteinmenge Diamond ProQ – phosphorylierte Proteine (s. auch Posttranslationale Modifikation) Emerald ProQ – glykosylierte Proteine (s. auch Posttranslationale Modifikation)