Milzbrandtoxin (auch: Anthrax-Toxin) ist ein Proteingemisch, das vom Milzbrand-Erreger, dem Bakterium Bacillus anthracis produziert wird und das verantwortlich für die Gefährlichkeit einer Milzbrandinfektion ist. Es wird vom Bakterium während der Infektion ausgeschieden, dringt in die Zellen des Wirts ein und verursacht ihre Zerstörung.
Die Untereinheiten des Milzbrandtoxins heißen Protektives Antigen (PA), Letalfaktor (LF) und Ödemfaktor (EF). Die sich aus dem Milzbrandtoxin bildenden Proteinkomplexe gehören zur großen Gruppe der Bacillus- und Clostridium-Exotoxine, die aus zwei sich funktionell ergänzenden Untereinheiten aufgebaut sind (AB-Toxine): PA+LF ist das Letaltoxin und PA+EF das Ödemtoxin.
Für die Strukturbiologie ist Milzbrandtoxin ein besonders zugängliches Modell, um die Mechanismen beim Transmembrantransport großer Proteine zu untersuchen. Obwohl die Einzelheiten des Vergiftungsprozesses durch Milzbrandtoxin ausgiebig untersucht wurden, sind aufgrund der Komplexität des Vergiftungsgeschehens noch nicht alle Fragen beantwortet. Trotzdem stehen neben Antibiotika mehrere Impfungen und hochwirksame Antikörper für die Behandlung zur Verfügung.H. Katayama, B. E. Janowiak u. a.: GroEL as a molecular scaffold for structural analysis of the anthrax toxin pore. In: Nature structural & molecular biology. Band 15, Nummer 7, Juli 2008, S. 754–760, doi:10.1038/nsmb.1442. PMID 18568038. .
Geschichte Milzbrand war die erste Krankheit, bei der als Ursache die Infektion mit Mikroorganismen zweifelsfrei nachgewiesen werden konnte. Robert Koch gelang es nicht nur, im Jahr 1876 den Krankheitserreger (Bacillus anthracis) im Labor zu vermehren, er wies außerdem dessen Sporenbildung nach und konnte gesunde Tiere damit krank machen. Dieser erste Nachweis eines Übertragungswegs leitete das so genannte goldene Zeitalter der Mikrobiologie ein.R. Koch: Untersuchungen über Bakterien: V. Die Ätiologie der Milzbrand-Krankheit, begründet auf die Entwicklungsgeschichte des Bacillus anthracis. (PDF; 11,1 MB). In: Beitrage zur Biologie der Pflanzen. 2 (2), 1876, S. 277–310. Cohns Nur wenige Jahre später entwickelte Louis Pasteur einen Impfstoff für Schafe, nachdem er zuvor mit Geflügelcholera-Bakterien (Pasteurella multocida) das Prinzip der Abschwächung der Virulenz (Attenuierung) durch Kultur bei erhöhter Temperatur demonstriert hatte. Die historischen Feldversuche fanden 1881 in Pouilly-le-Fort statt.L. Pasteur, Chamberland und Roux: De l'attenuation des virus et de leur retour à la virulence. In: Comptes rendus. 92, 1881, S. 492P. Mikesell, B.E. Ivins u. a.: Plasmids, Pasteur, and Anthrax. (PDF; 199 kB) In: ASM News. 49, 1983, S. 320
Die Menge und Qualität der Veröffentlichungen über Milzbrandtoxin in den Jahren 1953 bis 1968 ist bemerkenswert, im Gegensatz zum fast völligen Fehlen derselben zwischen 1969 und den frühen 1980er Jahren. Im Jahr 1954 wurde erstmals gezeigt, dass das Blutserum infizierter und spät mit Antibiotika behandelter Meerschweinchen Toxine enthält. In den Jahren bis 1962 entwickelten britische und amerikanische Forscher die Methoden zur Isolierung und Reinigung der Untereinheiten LF, EF und PA. Als klar wurde, dass das Ödemtoxin (s. u.) nicht tödlich ist, konzentrierte man sich ausschließlich auf die Untersuchung des Letaltoxins. Die Entdeckung im Jahr 1962, dass ein spezieller Laborratten-Stamm, die so genannte Fischer-Ratte, hochsensibel auf das Toxin reagiert, wird auch heute noch zur Messung der Reinheit einer Toxinpräparation benutzt.H. Smith, J. Keppie: Observations on experimental anthrax; demonstration of a specific lethal factor produced in vivo by Bacillus anthracis. In: Nature. Band 173, Nummer 4410, Mai 1954, S. 869–870. PMID 13165673.F. A. Beall, M. J. Taylor, C. B. Thorne: Rapid lethal effect in rats of a third component found upon fractionating the toxin of Bacillus anthracis. In: Journal of bacteriology. Band 83, Juni 1962, S. 1274–1280. PMID 13866126. .
Vergiftungsprozess mini|500px|Schema des Vergiftungsprozesses. In der Darstellung fehlt die Auflösung des PA-63-Rezeptorkomplexes nach Ansäuerung des Endosoms, mit Bildung der Pore. Sind die Lebensbedingungen für B. anthracis günstig, bilden sich aus den Endosporen wieder Bakterien; dies geschieht beispielsweise auf der Haut, in der Lunge oder im Darm von Wirbeltieren, wobei die Proteine LF, PA und EF in großen Mengen produziert und sezerniert werden. Außerhalb des Bakteriums kürzt eine Protease das PA zu PA-63 und dieses bildet an der Wirtszelle eine Präpore, die maximal vier Moleküle LF und/oder EF binden kann. Nach der Einschleusung des Toxins in die Wirtszelle ist es Bestandteil eines Endosoms, das innerhalb von Minuten zum Lysosom reift, dadurch werden die Proteine im Innern einer starken Ansäuerung ausgesetzt. Dies führt bei der Präpore zur Bildung einer „Klammer“, die aus dem Ring ein Porenbildendes Toxin macht, die die Membran durchdringt und worüber die gebundenen LF- und EF-Einheiten ins Zytosol gelangen.G. van der Goot, J. A. Young: Receptors of anthrax toxin and cell entry. In: Molecular aspects of medicine. Band 30, Nummer 6, Dezember 2009, S. 406–412, doi:10.1016/j.mam.2009.08.007. PMID 19732789. . (Review).R. J. Collier: Membrane translocation by anthrax toxin. In: Molecular Aspects of Medicine. Band 30, Nummer 6, Dezember 2009, S. 413–422, doi:10.1016/j.mam.2009.06.003. PMID 19563824. . (Review).
Sind LF und EF frei im Zytosol, können ihre disruptiven Funktionen nicht gestoppt werden. Aufgrund ihrer Enzymeigenschaft werden sie dabei auch nicht verbraucht. LF ist eine Protease, die insbesondere in den MAPKK-Signalweg eingreift, während EF als Adenylylcyclase ein Übermaß an cAMP produziert und die Überexpression der Milzbrandtoxin-Rezeptoren veranlasst. Die Eskalation durch große Toxinmengen führt zum Zelltod.
Da alle Zellen sensibel gegenüber Milzbrandtoxin sind und das Absterben der Zellen des angeborenen Immunsystems die Infektion begünstigt, werden als Teil der Immunantwort immer größere Mengen Interleukine ausgeschüttet. Der dadurch resultierende Schock mit Atmungs- und Herzversagen ist letztlich die Todesursache für den Wirt. Wird das Toxin direkt appliziert, verläuft das Krankheitsbild anders als bei einer Infektion. Hier ist kein systemischer Schock, sondern die Zerstörung von Blutgefäßen die letztliche Todesursache. Außerdem haben einzelne Wirbeltierarten (Nagetiere, Frösche) eine besondere Sensibilität auf das Toxin und können innerhalb weniger Stunden daran sterben, während eine letale Infektion Tage beanspruchen kann.
Die Untereinheiten PA, LF, EF Die Pathogenität des Milzbrandbakteriums ist hauptsächlich mit der Anwesenheit der beiden Plasmide pXO1 und pXO2 verknüpft, die 110 und 60 Megadalton schwer sind. Während pXO2 unter anderem für die Polyglutamathülle des Bakteriums codiert, enthält pXO1 den genetischen Code für die Toxin-Untereinheiten als Teil einer so genannten Pathogenitätsinsel, die sich zwischen den Positionen 117177 und 162013 (gesamt im Plasmid 181654 Basenpaare) erstreckt und acht identifizierte Gene enthält. Drei davon, die Gene pagA, lef und cya codieren für die Proteine PA, LF und EF. Sobald ein Schwellenwert an Carbonsäuren oder Kohlenstoffdioxid überschritten wird, reagiert der Transkriptionsfaktor atxA (Teil eines noch unbekannten Zweikomponentensystems) und startet die Expression der Pathogenitätsfaktoren Toxin plus Polyglutamat. Die Untereinheiten PA, LF und EF werden im Verhältnis 20:5:1 ausgeschüttet.R. T. Okinaka, K. Cloud u. a.: Sequence and organization of pXO1, the large Bacillus anthracis plasmid harboring the anthrax toxin genes. In: Journal of bacteriology. Band 181, Nummer 20, Oktober 1999, S. 6509–6515. PMID 10515943. .R. Bhatnagar, S. Batra: Anthrax toxin. In: Critical reviews in microbiology. Band 27, Nummer 3, 2001, S. 167–200, doi:10.1080/20014091096738. PMID 11596878. (Review).
Protektives Antigen (PA)
mini|Oberflächenmodell der Präpore des Milzbrandtoxins (PA-63-Octamer, von zwei Seiten) nach PDB mini|Oberflächenmodell des siebenfachen PA-63-ATR2-Komplexes. Die Rezeptormoleküle (blau) sind unvollständig und ihre Fortsetzung durch die Zellmembran mit Strichen angedeutet. Nach PDB . Das protektive Antigen (PA) ist ein Protein, das in einer Länge von 735 Aminosäuren von B. anthracis ausgeschieden wird. In der verkürzten Form (PA-63; 568 Aminosäuren) ist es Bestandteil des Milzbrandtoxins und lagert sich mit sieben weiteren Einheiten PA-63 zur achtteiligen Präpore zusammen. Diese Präpore bindet eine oder mehrere der LF/EF-Untereinheiten, veranlasst durch Bindung an einen Wirtsrezeptor die Einschleusung in eine Wirtszelle mittels Endozytose, und wandelt sich schließlich innerhalb des Endosoms zur ausgewachsenen Pore, welche die Ausschleusung der LF/EF-Untereinheiten aus dem Endosom ins Zellinnere (Zytosol) bewirkt. Diese Transportfunktion von PA-63 ist essenziell für die Pathogenität des Bakteriums.J. G. Bann: Anthrax toxin protective antigen–insights into molecular switching from prepore to pore. In: Protein science : a publication of the Protein Society. Band 21, Nummer 1, Januar 2012, S. 1–12. doi:10.1002/pro.752. PMID 22095644.
Die Transportgleichung der Pore lautet: LF oder EF (Endosom-Innenraum) LF oder EF (Zytosol)
Expression, Modifikation, Oligomerisierung Das auf dem Plasmid pXO1 positionierte pagA-Gen (2294 Basenpaare) codiert für ein 764 Aminosäuren langes Vorläuferprotein, das eine 29 Aminosäuren lange Signalsequenz am Translationsanfang enthält. Das Sec-Transportsystem in der Zellmembran des Bakteriums erkennt diese Signalsequenz und veranlasst daraufhin die Sekretion des noch ungefalteten Proteins, wobei die Signalsequenz abgetrennt wird. Das extrazelluläre Chaperon prsA hilft dem nunmehr 735 Aminosäure langen PA-83 bei der Faltung in die endgültige Form.
Darüber, wo genau im Wirt das PA-83 zum PA-63 gekürzt wird, gibt es widersprüchliche Ergebnisse. In jedem Fall spaltet eine Protease weitere 167 Aminosäuren von PA-83 ab. Erst diese Kürzung legt die Proteindomänen frei, die es den Faktoren LF und EF erlauben, an PA-63 zu binden. Und erst jetzt ist PA-63 in der Lage, sich mit mehreren gleichen Einheiten zu einer ringförmigen Präpore zusammenzulagern. Obwohl noch unklar ist, ob die bevorzugte Form von PA-63 das Heptamer oder Octamer ist, scheint das Octamer bei den Bedingungen, die bei einer Infektion herrschen, stabiler als das Heptamer zu sein. Gleichwohl können beide Formen die Endozytose an Wirtszellen-Rezeptoren veranlassen.
Bindung an Wirtsrezeptoren