mini|hochkant=2|Abb. 1: Analytik von Lebensmittel-Farbstoffen in Proben: HPTLC-Chromatogramm von beiden Seiten entwickelt (A), Mehrwellenlängenscan von Mix 1 (B), Kalibrierfunktion (C), Massenspektren (D), quantitative Analyse (E)
Die Hochleistungsdünnschichtchromatographie (HPTLC von engl. high-performance thin-layer chromatography) ist ein physikalisch-chemisches Trennverfahren und eine Weiterentwicklung der klassischen Dünnschichtchromatographie (DC), bei dem Hochleistungstrennschichten unter Einsatz von Geräten verwendet werden. Unter den planar-chromatographischen Methoden, zu denen noch die Papierchromatographie und die DC zählen, ist die HPTLC derzeit die leistungsstärkste.
Geschichte Bereits Mitte der 1960er Jahre gelang es, die DC als quantitative Methode zu verwenden.H. Jork: Direkte spektralphotometrische Auswertung von Dünnschicht-Chromatogrammen im UV-Bereich. In: Fresenius’ Zeitschrift für Analytische Chemie. Band 221, 1966, S. 17. doi:10.1007/BF00519562.
1975 wurde der Begriff HPTLC eingeführt,HPTLC: High Performance Thin-Layer Chromatography. In: A. Zlatkis, R. E. Kaiser (Hrsg.): Journal of Chromatography Library. Vol. 9, 1977, S. 11. als die ersten Fertigschichten eingeführt wurden. Der Begriff „HPTLC“ wird seitdem mit einer sehr hohen Trenneffizienz (Trennzahl max. 40), Präzision (typischerweise ≤ 2 %) und Detektierbarkeit (bis in den Pikogramm pro Zone-Bereich) verbunden. Der Begriff wird aber unterschiedlich gehandhabt; eine einheitliche Verwendung ist international noch nicht erkennbar. Teilweise wird die Auffassung vertreten, um HPTLC handele es sich nur, wenn ein apparativer Probenauftrag und eine Auswertung bei einer Trennung auf entsprechenden Platten vorgenommen wird, teilweise wird von HPTLC bei Verwendung entsprechender Trennschichten gesprochen.
1978 kamen modifizierte HPTLC-Fertigschichten und 1984 mit der automatisierten Mehrfachentwicklung eine trennleistungsstarke Entwicklungstechnik auf den Markt.
Sphärische HPTLC-Fertigschichten kamen 1995 hinzu, während monolithische Fertigschichten seit 2001 kommerziell erhältlich sind. Techniken mit Letzteren werden auch als „ultrathin-layer chromatography“ (UTLC) bezeichnet, da Merck diese Schichten unter diesem Handelsnamen vertreibt. UTLC bezeichnet aber auch die miniaturisierte Weiterentwicklung der Methode. Seit etwa 2000 wird auch an der Kopplung an die Massenspektrometrie gearbeitet.G. E. Morlock, W. Schwack: Coupling of planar chromatography to mass spectrometry. In: Trends Anal Chem. Band 29, Nr. 10, 2010, S. 1157–1171. doi:10.1016/j.trac.2010.07.010.
Die instrumentelle Entwicklung ist detailliert in einer chronologischen Listung erfasst.J. Sherma, G. Morlock: Chronology of thin-layer chromatography focusing on instrumental progress. In: J Planar Chromatogr. Band 21, 2008, S. 471. doi:10.1556/JPC.21.2008.6.15 Inzwischen sind alle HPTLC-Schritte (Auftragung, Entwicklung, Derivatisierung, Dokumentation, Densitometrie) standardisiert und automatisiert.
Grundlagen der Methode Um die volle Leistungsstärke der HPTLC zu erreichen, sollten sowohl entsprechende Geräte zur Probenauftragung und Auswertung als auch HPTLC-Trennschichten in Kombination verwendet werden. Durch den Einsatz von, im Vergleich zur DC, leistungsstärkerem Trennmaterial (kleinere Korngröße von 5 bis 7 µm, engere Korngrößenverteilung, homogenere Schichtdicke), automatisierten Geräten für die einzelnen Arbeitsschritte und standardisierten Methoden ist es mit der HPTLC nicht nur möglich, eine qualitative, sondern auch eine schnelle quantitative Analyse von Proben aller Art durchzuführen (Abb. 1). Bei hohem Probendurchsatz ist z. B. die Trennzeit pro Probe 20 s bei einem Fließmittelverbrauch von 200 µl.G. Morlock, C. Oellig: In: CAMAG Bibliography Service. Band 103, 2009, S. 5.
HPTLC-Fertigschichten mini|hochkant=2.8|Abb. 2: Vielfalt der HPTLC-Fertigschichten
Die stationäre Phase ist auf Trägermaterialien wie Glas oder Aluminiumfolien aufgebracht. Standardformate sind 10 cm × 10 cm bzw. 20 cm × 10 cm.
Die gebräuchlichste HPTLC-Fertigschicht ist Kieselgel, da sie für ca. 90 % aller HPTLC-Trennungen eingesetzt wird. Diverse Hersteller bieten verschiedene polare Kieselgelphasen an, z. B. wasserstabile, säurestabile oder hochreine Schichten. Die typische Schichtdicke ist 200 µm, es gibt aber auch dünnere Schichten von nur 100 oder 50 µm. Typischerweise verbessern sich auf dünneren Schichten die Detektierbarkeit und Laufzeit.
Die restlichen 10 % der HPTLC-Trennungen finden v. a. auf mittelpolaren und unpolaren Umkehrphasen (reversed phase, RP) RP-2-, 8- oder 18-Phasen statt (Abb. 2). Eine Besonderheit der mittelpolaren Schichten ist, dass diese wie Kieselgel für eine Normalphasentrennung eingesetzt werden können, aber in Kombination mit einem polareren Fließmittel auch für die Umkehrphasentrennung.
Beim Einsatz der HPTLC in der Spurenanalytik ist das Vorwaschen der Fertigschichten von Vorteil. Hierzu werden die Schichten in einem elutionsstarken Lösungsmittel chromatographiert, getrocknet, mit einer Gegenglasplatte bedeckt, in Aluminiumfolie gewickelt und bis zum Gebrauch in einem sauberen Exsikkator vor Kontaminationen geschützt gelagert.
Einfache Anpassung der Selektivität Trennungen werden in der DC am effektivsten durch die Anpassung der Selektivität optimiert. Die Selektivitätsbreite ist in der DC/HPTLC einzigartig.
Man kann Fertigschichten in geeignete Imprägnierlösungen tauchen oder aber die mobile Phase der geforderten Selektivität anpassen. Die einsetzbaren Lösungsmittel, organische wie anorganische, sind vielfältig, und es ist keine Limitierung bezüglich der z. B. UV-Durchlässigkeit, Wassermischbarkeit, Viskosität oder MS-Gängigkeit gegeben. Effektive Selektivitätsanpassungen sind beispielsweise die: Trennung von Verbindungen nach v. a. Anzahl und Lage ihrer Doppelbindungen (Komplexstabilität) auf einer mit Silbernitrat imprägnierten Schicht. Trennung von polyaromatischen Verbindungen nach Charge-Transfer-Komplexstabilität auf einer mit Coffein imprägnierten Schicht. Trennung von Phenolen oder Säuren – zur schärferen Spotform – auf einer mit anorganischen Säuren imprägnierten Schicht oder von Alkaloiden oder Aminen auf einer mit anorganischen Basen imprägnierten Schicht.
Auftragung Eine automatisierte, standardisierte, präzise und verschleppungsfreie Auftragung ist Voraussetzung für alle quantitativen HPTLC-Methoden. Das Auftragen der flüssig aufgearbeiteten Analysenprobe erfolgt am effektivsten automatisch, typischerweise durch bandförmiges Aufsprühen auf die HPTLC-Platte. Die Probe wird dabei mit Druckluft oder Stickstoff zerstäubt und der Einfluss des verwendeten Lösungsmittels durch das schnelle Abdampfen minimiert. Gleichzeitig verbessert sich durch die scharfe, bandenförmige Startzone – im Gegensatz zur punktförmigen Applikation – die Auflösung zwischen den einzelnen Komponenten.
Das Auftragevolumen der Probe kann von 100 nl bis 1 ml variieren. Gegenüber der DC sind die resultierenden Auftragemengen pro Zone deutlich reduziert, was die Auflösung verbessert. Nach der Auftragung erfolgt die homogene Trocknung der Startzonen. Voraussetzung für das Auftragen relativ großvolumiger, insbesondere wässriger oder matrixreicher, Analysenproben ist eine flächenförmige Auftragung. Zusätzlich kann die Auftragung bis 60 °C beheizt erfolgen. Flächenauftragung und beheiztes Auftragen reduzieren die erforderliche Auftragezeit signifikant.
Je nach Fließmittel ist dann vor der Trennung eine Frontelution der Analyten auf die Startzonen-Oberkante, sogenannte Fokussierung der Startzone, erforderlich (Dauer: einige Sekunden).
Eine sorgfältige Aufreinigung der Analysenprobe entsprechend der Säulenchromatographie HPLC (GC) ist nicht notwendig, denn Matrix (nicht interessierende Komponenten einer Probe) kann am Start verbleiben oder mit der Front wandern. Das einmalige Benutzen der Schicht ermöglicht die Beladung mit Matrix und so können Probenvorbereitung und Chromatographie sogar zeitgleich erfolgen.G. Morlock, M. Vega: Two new derivatization reagents for planar chromatographic quantification of sucralose in dietetic products. In: J Planar Chromatogr. Band 20, 2007, S. 411. doi:10.1556/JPC.20.2007.6.4
Entwicklung mini|hochkant=1|Abb. 3: Multiple Detektion in der EU zugelassener Süßstoffe auf der gleichen HPTLC-Platte (Reagenzfolge): Quantifizierung (1) im UV 254 nm (Saccharin), (2) im UV 366 nm nach Derivatisierung mit Primulin-Reagenz (Acesulfam-K, Na-Cyclamat), im sichtbaren Bereich nach Derivatisierung mit (3) Ninhydrin-Reagenz (Aspartam) und (4) β-Naphthol-Reagenz (Sucralose, Neohesperidin-Dihydrochalkon, Stevia (Rebaudiosid A))G. Morlock, G. Sabir: In: J. Planar Chromatogr., in submission.
Die Entwicklung der Platte mit dem Fließmittel, der eigentliche Trennvorgang, ist für das Ergebnis entscheidend. Die Standardisierung dieses Schrittes war wesentlich für die Reproduzierbarkeit der Methode, vor allem bei Luftfeuchte-anfälligen Systemen, z. B. wenn Kieselgelschichten mit unpolaren Fliessmitteln entwickelt werden. Moderne automatisierte Trennkammern kontrollieren die Plattenaktivität und das Kammerklima inklusive einer Vorkonditionierung der Platte, so dass reproduzierbare Chromatogramme routinemäßig erhalten werden. Durch Kapillarkräfte bewegt sich das Fließmittel durch die HPTLC-Schicht, nimmt lösliche Komponenten an den Startzonen auf und trennt diese je nach deren Wechselwirkungen mit dem Fließmittel und der stationären Phase im Verlauf der Entwicklung. Dabei erfolgt ein Abdampfen flüchtiger Fließmittel-Komponenten in den Dampfraum und ein Aufdampfen derselben auf den noch trockenen Teil der Schicht. Auch polare Komponenten des Fließmittels verarmen in einer Fließmittelmischung stärker als unpolare durch bevorzugte Adsorption an die aktive Schicht. Infolgedessen erfolgt bei Fließmittelgemischen eine unbewusste Gradiententrennung. Diese verläuft heute mit modernen automatischen Trennkammern reproduzierbar. Zudem wird die Laufstrecke automatisch überwacht und bei Erreichen der Endhöhe die Platte sofort und sehr homogen getrocknet. Laufstrecken (Abstand Startzonenmitte zu Frontlinie) sollten 60 mm nicht überschreiten, denn höhere Laufstrecken führen zwar zu einer besseren Zonentrennung, aber eben auch – durch Diffusion – zu einer größeren Zonenbreite und letztlich nicht zu einer verbesserten Auflösung zwischen Zonen. Zudem nimmt die Chromatographiezeit mit der Trennstrecke exponentiell zu, und der höhere Zeitaufwand rechtfertigt keinesfalls die höhere Trennstrecke. Weitaus sinnvoller ist es, die Selektivität einer Trennung zu optimieren und kurze Trennstrecken zu wählen. Hinsichtlich der Matrix ist eine Trennung so zu optimieren, dass Matrixkomponenten nicht mit dem Fließmittel wechselwirken und entweder an der Startzone zurückbleiben oder mit der Front wandern. Alle Probebestandteile (ausgenommen leichtflüchtige) sind auf Grund der offenen planaren Schicht der Detektion zugänglich. Bei nachträglichem Interesse z. B. an den Matrixzonen kann die gleiche Platte nochmals mit einem elutionsstärkeren Fließmittel chromatographiert werden oder bei Frontelution mit einem elutionsschwächeren. Diese Flexibilität in der Chromatographie, die umfassende Detektierbarkeit ansonsten unsichtbarer Probebestandteile (im Gegensatz zur HPLC) und die Analyse der weitgehend unveränderten Probe (reduzierte Probenvorbereitung) sind Stärken der HPTLC.
Dokumentation Die Lage der getrennten Zonen wird anhand ihres Rf-Wertes bzw. hRf-Wertes durch Bildaufnahmen der Platte unter 254 nm, 366 nm und Weißlichtbeleuchtung durch elektronische Dokumentationssysteme belegt.
Gegenüber der DC ist in der HPTLC die Substanzmenge pro Zone deutlich reduziert. So sind sichtbare Zonen bei visueller Betrachtung der Platte kaum sichtbar. Durch die elektronische Dokumentation werden auch schwache Zonen auf der Platte gut sichtbar, z. B. durch die Durchlichtaufnahme und Bildbearbeitungswerkzeuge.
Derivatisierung