mini|Typ-I CRISPR-surveillance-complex (Cas, blau) mit gebundener Ziel-DNA (orange) CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) sind Abschnitte sich wiederholender DNA (repeats), die durch ähnlich lange, sich nicht wiederholende Zwischenstücke (spacer) getrennt sind, und im Erbgut vieler Bakterien und Archaeen auftreten. Sie dienen einem Mechanismus, dem CRISPR/Cas-System, der Resistenz gegen das Eindringen fremden Erbguts von Viren oder Plasmiden verschafft, und sind hierdurch ein Teil des Immunsystem-Äquivalents vieler Prokaryoten. Dieses System bildet die Grundlage der gentechnischen CRISPR/Cas-Methode zur Erzeugung gentechnisch veränderter Organismen.
Entdeckung und Eigenschaften Die Existenz sich wiederholender DNA-Abschnitte (repeats), die durch Abstandsstücke (spacer) ähnlicher Länge getrennt sind, und die heute als CRISPR bekannt sind, wurde bereits 1987 im Bakterienstamm Escherichia coli K12 von Yoshizumi Ishino und Kollegen erstmals entdeckt. Sie identifizierten eine sich wiederholende Sequenz von 29 Nukleotiden, die von variablen Regionen mit jeweils 32 Nukleotiden unterbrochen wurden.Y. Ishino, H. Shinagawa K. Makino M. Amemura A. Nakata A: Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product. In: Journal of Bacteriology. Band 169, 1987, S. 5429–5433. Ab 1991 wurden ähnliche DNA-Muster von einer Arbeitsgruppe um den niederländischen Biochemiker Jan van Embden auf der DNA der Vertreter des Mycobacterium tuberculosis-Komplexes entdeckt und erst als „Direct Repeats“ (DR), dann als „Direct Variable Repeats“ (DVR) bezeichnetP. M. Groenen, A. E. Bunschoten, D. van Soolingen, J. D. van Embden: Nature of DNA polymorphism in the direct repeat cluster of Mycobacterium tuberculosis; application for strain differentiation by a novel typing method. In: Molecular Microbiolology. Band 10, 1993, S. 1057–1065.. Da sich die Stämme von M. tuberculosis in der Zusammensetzung der DVR unterscheiden, konnte die Forschergruppe ein Typisierungsverfahren entwickeln, das Spoligotyping, mit dem es gelang, Tuberkuloseausbrüche besser zu identifizieren und zu erforschen als mit vorhergehenden Verfahren.
1993 erfolgte die erste Beschreibung des Sequenzmusters bei Vertretern von Archaeen, und zwar bei den salzliebenden Meereseinzellern Haloferax mediterranei und 1995 bei Haloferax volcanii durch den spanischen Mikrobiologen Francisco Mojica und seine Kollegen, die das Muster zunächst irrigerweise als „Tandem Repeats“ (TREPs) bezeichneten.F. J. Mojica, C. Ferrer, G. Juez, F. Rodriguez-Valera: Long stretches of short tandem repeats are present in the largest replicons of the Archaea Haloferax mediterranei and Haloferax volcanii and could be involved in replicon partitioning. In: Molecular Microbiology. Band 17, 1995, S. 85–93. Die Arbeitsgruppe um Mojica identifizierte weitere Bakterien und Archaea mit entsprechenden Sequenzen und wählte für diese sich gleichenden Wiederholungen eine neue Bezeichnung als „Short Regularly Spaced Repeats“ (SRSR).F. J. Mojica, C. Diez-Villasenor, E. Soria, G. Juez: Biological significance of a family of regularly spaced repeats in the genomes of Archaea, Bacteria and mitochondria. In: Molecular Microbiology. Band 36, 2000, S. 244–246. In der Literatur kamen weitere Namen hinzu, die ebenfalls diese Sequenzen bezeichneten, etwa „spacer interspersed and direct repeats“ (SPIDRs) und „long clustered tandem repeats“ (LCTRs). 2002 wurde dann durch Ruud Jansen aus der Arbeitsgruppe um Jan van Embden erstmals der Begriff „Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats“, kurz CRISPR, verwendet. Jansen hatte in Kontakt mit Mojica gestanden, und sie beschlossen, der Vielfalt der Bezeichnungen ein Ende zu machen und einen neuen Namen einzuführen. Mojica hatte dann nach eigener Aussage die Idee für das CRISPR-Akronym. Jansen teilte Mojica in einer E-Mail vom 21. November 2021 seine Begeisterung mit, auch weil CRISPR in der medizinischen Datenbank Medline einen eindeutigen Eintrag („a unique entry“) erzeugt, was für die Auffindbarkeit der Artikel wichtig ist.
Sowohl Mojica als auch Jansen hatten zeigen können, dass ähnliche Strukturen im Genom vieler verschiedener Prokaryoten existieren. Jansen und Kollegen entdeckten zusätzlich eine Gruppe von Genen, die in allen untersuchten Organismen nahe am Genlokus der CRISPR lagen und daher cas-Gene (CRISPR-associated) genannt wurden.R. Jansen, J. D. Embden, W. Gaastra, L. M. Schouls: Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes. In: Mol Microbiol. Band 43, 2002, S. 1565–1575. Sie identifizierten vier verschiedene Cas-Core-Sequenzen (Cas1 bis Cas4). 2005 wurden durch Haft und Kollegen insgesamt 41 entsprechende Gene und zwei weitere Cas-Core-Sequenzen (Cas5 und Cas6) und insgesamt acht Subtypen von CRISPR/Cas-Systemen beschrieben.D. H. Haft, J. Selengut, E. F. Mongodin, K. E. Nelson: A guild of 45 CRISPR-associated (Cas) protein families and multiple CRISPR/Cas subtypes exist in prokaryotic genomes. In: PLoS Comput. Biol. 1, 2005; e60.Sinan Al-Attar, Edze R. Westra, John van der Oos, Stan J.J. Brouns: Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPRs): the hallmark of an ingenious antiviral defense mechanism in prokaryotes. In: Biological Chemistry. Band 392, 2011, S. 277–289. doi:10.1515/BC.2011.042, (Volltext)
Heute ist bekannt, dass das Genom von etwa 45 % der bislang sequenzierten Bakterien und 83 % der Archaeen mindestens eine CRISPR-Struktur enthält.125/150 Archaeen, 1126/2480 Bakterien , Stand: 19. Januar 2013.
Pathogene der Art Francisella verwenden das CRISPR-Cas-System zur Immunevasion.T. R. Sampson, D. S. Weiss: Alternative roles for CRISPR/Cas systems in bacterial pathogenesis. In: PLoS pathogens. Band 9, Nummer 10, 2013, S. e1003621, . doi:10.1371/journal.ppat.1003621. PMID 24146613. . Bei Neisseria meningitidis und Campylobacter jejuni ist das System ein Pathogenitätsfaktor mit bisher unbekanntem Mechanismus.
Struktur mini|Vereinfachtes Diagramm des CRISPR-Genlocus. Die grauen Boxen stellen die Repeats und die bunten Striche die Spacer dar. Die Anordnung kann in verschiedenen Organismen variieren.L. A. Marraffini, E. J. Sontheimer: CRISPR interference: RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archaea. In: Nature Reviews Genetics. Band 11, Nummer 3, März 2010, S. 181–190, doi:10.1038/nrg2749. PMID 20125085, (Review).
Der CRISPR-Genlocus besteht wesentlich aus zwei Hauptkomponenten: dem cas-Gene enthaltenden cas-Operon und dem CRISPR-Array, der sich aus einer leader-Sequenz und einer Repeat-Spacer-Sequenz (auch Repeat-Spacer-Array genannt) zusammensetzt.E. Charpentier, H. Richter, J. van der Oost, M. F. White: Biogenesis pathways of RNA guides in archaeal and bacterial CRISPR-Cas adaptive immunity. In: FEMS microbiology reviews. Band 39, Nummer 3, Mai 2015, S. 428–441, doi:10.1093/femsre/fuv023. PMID 25994611, (Review).
Repeat-Spacer-Sequenz Die Einzelsequenzen des sich wiederholenden Grundmotives (Repeats) haben eine Länge, die zwischen 23 und 47 bp variiert. Die Repeats wechseln sich ab mit Spacern, die eine Länge von 21 bis 72 bp haben. Während innerhalb einer CRISPR-Struktur die sich wiederholende Sequenz erhalten bleibt, variiert die Sequenz der CRISPR in verschiedenen Mikroorganismen stark.A. Horvath, R. Barrangou: CRISPR/Cas, the Immune System of Bacteria and Archaea. In: Science. Band 327, 2010, S. 167. Die Sequenz von CRISPR-Repeats der Bakterien ist in der Regel palindromisch (d. h. spiegelverkehrt komplementär), was eine stabile Sekundärstruktur der zugehörigen RNA zur Folge hat, wohingegen die meisten Repeats der Archaeen nicht palindromisch sind.
Die Sequenzen der Spacer-Abschnitte variieren stark, sowohl innerhalb einer CRISPR-Struktur als auch in verschiedenen Prokaryoten. 2005 wurde entdeckt, dass die Spacer-Sequenzen mit Fremd-DNA aus Bakteriophagen und Plasmiden identisch sind.F. J. Mojica, C. Diez-Villasenor, J. Garcia-Martinez, E. Soria: Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements. In: Journal of Molecular Evolution. Band 60, 2005, S. 174–182.C. Pourcel, G. Salvignol, G. Vergnaud: CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studies. In: Microbiology. Band 151, 2005, S. 653–663.A. Bolotin, B. Quinquis, A. Sorokin, S. D. Ehrlich: Clustered regularly interspaced short palindrome repeats (CRISPRs) have spacers of extrachromosomal origin. In: Microbiology. Band 151, 2005, S. 2551–2561. Dies führte zur Hypothese, dass die Funktion von CRISPR darin besteht, den Organismus gegen Fremd-DNA zu verteidigen.
cas-Operon Auch zum CRISPR-Genlocus gehörend ist das cas-Operon. Das cas-Operon enthält cas-Gene und die zu codierenden Proteine, die für die adaptive Immunantwort notwendig sind, z. B. Helikasen, Nukleasen, aber auch Proteine mit Eigenschaften zur RNA-Bindung. cas-Gene lassen sich in zwei Module gliedern: dem Effektor- und dem Adaptationsmodul. Unter einem Effektormodul versteht man eine Gruppe von cas-Genen, die zur Identifizierung von genetischem Material dient. Das Adaptationsmodul enthält ebenfalls cas-Gene und trägt mithilfe von Effektorproteinen zur Protospacer-Auswahl bei, die in das bakterielle Genom integriert werden können.Donghyun Ka, Dong Man Jang, Byung Woo Han, Euiyoung Bae: Molecular organization of the type II-A CRISPR adaptation module and its interaction with Cas9 via Csn2. In: Nucleic Acids Research. 46, 2018, S. 9805, doi:10.1093/nar/gky702.Eugene V. Koonin: CRISPR: a new principle of genome engineering linked to conceptual shifts in evolutionary biology. In: Biology & Philosophy. Band 34, 2019, doi:10.1007/s10539-018-9658-7.
leader-Sequenz In der Nähe der Repeat-Spacer-Sequenz befindet sich eine sogenannte leader-Sequenz (nicht zu verwechseln mit der Leader-Sequenz der mRNA). Die leader-Sequenz ist eine Adenin- und Thymin-reiche Sequenz mit einer Länge von 100–500 bp. Wie bei den Repeats sind leader-Sequenzen innerhalb eines Genoms zu ca. 80 % identisch, aber weisen innerhalb verschiedener Organismen starke Unterschiede auf. Als nichtcodierende Sequenz lässt sich diese in zwei Bereiche aufteilen: einem core leader und einem extended leader. Der core leader ist in mehreren Organismen konserviert und mit einer Länge von 20–300 bp in der Regel kürzer als der extended leader. Außerdem verfügt der core leader über ein Promotorelement, an dem sich Regulatorproteine binden können, um so die Genexpression, genauer die Initiation der CRISPR-Transkription, und die Spacer-Akquirierung kontrollieren zu können.
Der extended leader ist mit einer Länge von 50–500 bp länger als der core leader und enthält ebenfalls in den CRISPR-fernen Regionen konservierte Sequenzen, die vermutlich durch Genduplikation zustande gekommen sind. Die Funktionen des extended leaders sind zurzeit unbekannt. Vermutlich hat der extended leader keine wichtigen Funktionen.Omer S. Alkhnbashi, Shiraz A. Shah, Roger A. Garrett, Sita J. Saunders, Fabrizio Costa, Rolf Backofen: Characterizing leader sequences of CRISPR loci. In: Bioinformatics. Band 32, Nummer 17, 1. September 2016, S. i576–i585, doi:10.1093/bioinformatics/btw454.
Immunität durch CRISPR mini|Der CRISPR Gen-Locus verleiht Bakterien adaptive Immunität gegen wiederholte Phageninfektionen. mini|Transkripte des CRISPR Gen-Locus und Reifung der prä-crRNA.
Die Immunität durch CRISPR erfolgt in drei Schritten, wobei die letzten beiden Schritte bei den jeweiligen CRISPR/Cas-Systemtypen unterschiedlich verlaufen.